Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Бореко Евгений Иванович Савинова Ольга ВладимировнаПавлова Наталья ИльиничнаКазакова Оксана Борисовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(57) Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток, отличающийся тем, что на монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3,28-диоксим бетулина в концентрации до 50 мкг/мл. Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемых ими заболеваний. Известен способ подавления репродукции вируса гриппа с использованием 3,28 диоксима бетулина 1. Недостатком способа является относительно невысокая противовирусная активность. Более интенсивное снижение репродукции вируса гриппа может быть достигнуто с использованием ремантадина 2-4. Недостатком такого способа ингибирования вируса в отдельных случаях также является сниженная активность 4. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием. Поставленная задача достигается в способе подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток. На монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3,28-диоксим бетулина в концентрации до 50 мкг/мл. 13281 1 2010.06.30 Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить 3,28-диоксим бетулина и ремантадин для увеличения противовирусного действия. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Токсическое действие 3,28-диоксима бетулина для культуры клеток. Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первичнотрипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и наносят разведения 3,28-диоксима бетулина на среде поддержки (среда 199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. 3,28-Диоксим бетулина предварительно растворяют в 10 этаноле (маточный раствор). По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив 10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне концентраций от 200 мкг/мл и более низких 3,28-диоксим бетулина не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 2. Токсическое действие ремантадина для культуры клеток. Исследование, описанное в примере 1, выполняют с ремантадином. Устанавливают,что в диапазоне концентраций от 12,5 мкг/мл и более низких ремантадин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток. Пример 3. Противовирусное действие 3,28-диоксима бетулина. Исследование проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса гриппа //34 (71) в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе концентрата среды 199 с добавлением 1 бактагара и 0,005 нейтрального красного (все реактивы) и различных концентраций исследуемого соединения. 3,28-Диоксим бетулина предварительно растворяют в 10 этаноле (маточный раствор). После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают количество бляшек,видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрацию 50 подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация, ЕС 50) и отношение МПК к ЕС 50. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС 50 3,28-диоксима бетулина составляет 8,2 (10,16,7) мкг/мл, отношение МПК/ЕС 50 - 24. Пример 4. Противовирусное действие ремантадина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с ремантадином. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС 50 ремантадина составляет 0,003 (0,010,0009) мкг/мл, отношение МПК/ЕС 50 - 4 167. Пример 5. Противовирусное действие 3,28-диоксима бетулина и ремантадина при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями 3,28-диоксима бетулина и 0,1 мкг/мл ремантадина. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС 50 3,28-диоксима бетулина в присутствии ремантадина составляет 0,5 (1,00,3) мкг/мл, отношение МПК/ЕС 50 - 400. 13281 1 2010.06.30 Пример 6. Противовирусное действие ремантадина и 3,28-диоксима бетулина при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями ремантадина и 6,0 мкг/мл 3,28-диоксима бетулина. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС 50 ремантадина в присутствии 3,28-диоксима бетулина составляет 0,00025 (0,020,000004) мкг/мл, отношение МПК/ЕС 50 - 50 000. Подавление репродукции вируса гриппа в культуре клеток ФЭК в присутствии 3,28-диоксима бетулина , ремантадинаи их сочетаний Разность с конШифр Концентрация, Титр ви,ЕС 50 (95),тролем,МПК/ЕС 50 вещества мкг/мл мкг/млБОЕ/мл БОЕ/мл 2,35 50 4,0 1,01 25 5,340,07 0,93 12,5 8,2 5,420,03 24 13281 1 2010.06.30 Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При совместном использовании 3,28-диоксима бетулина и ремантадина удается получить увеличение ингибирования репродукции вируса гриппа в культуре клеток в сравнении с индивидуальным применением веществ. При оценке по среднеэффективной концентрации или по отношению МПК/ЕС 50 активность 3,28-диоксима бетулина увеличивается в 16,7 раза, ремантадина - в 12 раз. Значение фракционального индекса ингибирования (ФИИ),рассчитанное по формуле ФИИЕС 50 в-ва А в комбинации/ЕС 50 в-ва А в отдельностиЕС 50 в-ва Б в комбинации/50 в-ва Б в отдельности 5, составляет 0,14. Оно свидетельствует о синергизме комбинированного использования препаратов. Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции вируса гриппа и редукции вызываемых им заболеваний. Источники информации 1. Патент РБ 7811, МПК С 07 53/00, 63/00, А 61 Р 31/16, 2003. 2. Патент США 3,352,912, МПК 07 295/0007 295/0307 49/0007 49/323. 3. Патент США 3,592,934, МПК 07 295/0307 295/00. 4. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении гриппа // Медицинские новости, 1999. -3(47). - С. 20-25. 5.С,.// . . - 1982. - . 73. - . 135-143. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4