Конъюгат 28-гомокастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 28-гомобрассиностероидов

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ 28-ГОМОКАСТАСТЕРОНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 28-ГОМОБРАССИНОСТЕРОИДОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Литвиновская Раиса Павловна Райман Михаил Эдуардович Драч Светлана Васильевна Жабинский Владимир Николаевич Свиридов Олег Васильевич Прядко Андрей Георгиевич Новик Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси, где ПХ - пероксидаза хрена,в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 28-гомобрассиностероидов. Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-гомокастастерона - (22,23,24)-2,3,22,23 тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-она - с пероксидазой хрена формулы ,11835 1 2009.04.30,где ПХ - пероксидаза хрена,который может быть использован в качестве меченого стероида в аналитической тестсистеме для иммуноферментного определения 28-гомобрассиностероидов - 28-гомокастастерона и 28-гомобрассинолида. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1, 2. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях менее 10-5 . В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням 3-8. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является 28-гомобрассинолид, на основе которого разработан препарат ЭПИН-плюс 9. В связи с этим актуальной является разработка методов анализа 28-гомобрассинолида, а также его химического и биохимического предшественника 28-гомокастастерона (далее 28-гомобрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 28 гомобрассиностероидов, который, наряду с соответствующими антителами, требует наличия меченого антигена, в качестве которого может выступать стероид, конъюгированный с пероксидазой хрена. В настоящее время известен конъюгат брассиностероида с ферментной меткой - конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена формулы ,2-ПХ, который был использован в иммуноаналитической системе для определения 24 эпикастастерона и 24-эпибрассинолида (24-метилбрассиностероидов) 10, 11. Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена, как и ожидалось, является специфическим реагентом, позволяющим успешно проводить иммуноферментный анализ только целевых соединений (только 24-метилбрассиностероидов). Целью настоящего изобретения является ранее неизвестный конъюгат 28-гомокастастерона и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого стероида в иммуноферментном анализе 28-гомобрассиностероидов - 28-гомокастастерона и 28-гомобрассинолида. 2 11835 1 2009.04.30 Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом , который получают взаимодействием -оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси 24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты (гаптена) с пероксидазой хрена в водной среде в присутствии гидрокарбоната калия, очисткой на сефадексе и замораживанием раствора в глицерине. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Растворяют 0,031 г (0,056 ммоль) оксима (1) и 0,008 г (0,07 ммоль) -оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана. Охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 0,012 мг дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 20 часов при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 0,035 мг (94 ) 6-оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24 этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты. Маслообразное вещество. ИК спектр (пленка), (см-1) 1730 (СО), 1770 (С), 3400 (ОН). Спектр ЯМР 1 Н , м.д.(3) 0,67 с (3 Н, 18-Ме), 0,75 с (3 Н, 19-Ме), 0,90 д (3 Н,6,6 Гц, 26 ), 0,94 д (3 Н,6,7 Гц, 29-Ме), 0,95 д (3 Н,6 Гц, 21-Ме), 0,97 д (3 Н, 6,6 Гц, 27-Ме), 2,68 дд (1 Н, 1 2,5 Гц,2 12,5 Гц, С 5- Н), 2,73 м (4 Н), 3,58 д (1,8,4 Гц, С 22- Н), 3,72 м (2 Н, С 2- и С 23- Н),3,95 м (1, С 3-Н), 4,52 м (2 Н, -О-СН 2-СООН). К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 0,6 мл дит. воды в присутствии 2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 2 мг (0,003 ммоль) 6-оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5 холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты, перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дистиллированная вода. Собирают окрашенную желто-коричневую фракцию (10 мл), разбавляют глицерином (11) и хранят в морозильнике (при -18 С). Титр полученного конъюгата определяют как его рабочее разведение, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ. Типичным в проведенных экспериментах было рабочее разведение 130000-120000, т.е. специфическая активность конъюгата 28 гомокастастерон-пероксидаза хрена при таком разведении (титре) позволяет проводить иммуноферментный анализ в диапазоне концентраций анализируемого вещества 0,2100 нмоль/л, как следует из примера 2. Пример 2. В полистирольные лунки планшета с иммобилизованными антителами к 28 гомокастастерону вносят по 0,05 мл калибровочных проб или анализируемых образцов брассиностероидов в дубликатах. Вносят во все лунки по 0,1 мл фосфатно-буферного раствора конъюгата 28-гомокастастерон-пероксидаза хрена в глицерине. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при 37 С без встряхивания, затем удаляют жидкость из лунок и промывают их 3 -ным раствором , содержащим 0,0220. Во все промытые лунки добавляют по 0,15 мл хромоген-субстратной смеси - раствор 3,3,5,5 тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода - и инкубируют при 37 С в течение 15 минут. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 0,05 мл раствора стоп-реагента (5 раствор 24).позже чем через 30 минут проводят измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине волны 450 нм. Результаты анализа рассчитывают методом интерполяции по калибровочной кривой 12. Тест-система с использованием конъюгата 28-гомокастастерон-пероксидаза хрена в качестве меченого антигена обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения 3 11835 1 2009.04.30 28-гомокастастерона и 28-гомобрассинолида в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пкг БС в 50 мкл образца. Таким образом, заявляемый конъюгат 28-гомокастастерона с пероксидазой хрена получается с высоким выходом, обладает стабильностью, имеет необходимую иммунореактивность и позволяет проводить количественное определение 28-гомобрассиностероидов.. , 1999. - 456 . 3. Патент РБ 2806, 2000. 4. Патент РБ 3488, 2000. 5. Патент РБ 3400, 2000. 6. Патент РБ 5168, 2003. 7. Патент РБ 5212, 2003. 8. Патент РБ 5698, 2003. 9. ТУ РБ 100185129.048 - 2002. Брассиностероиды и препаративные композиции на их основе. - Введ. 2003-02-05. Каталог Технические условия - Мн. Из-во Госстандарт РБ,2007. Т.2. - С. 549. 10. Патент РБ 9771, МПК С 2 С 07 41/00, 2007. 11. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михайлопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24)-брассиностероидов // Биоорганическая химия. - 2007. - Т. 33. -3. - С. 371-378. 12. Егоров Теория и практика иммуноферментного анализа. - М. Высш. шк.,1991. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4