ДНК, вектор, белок, способ продуцирования, фармацевтическая композиция

Настоящее изобретение касается Новых интерферон-а/З-связьтватощих белков,способного модулировать активность различных подтипов интерферона-а (ЩИ-о), а также активность интерферона-В. Изобретение, в частности, касается клонирования молекул ДНК, кодирующих указанные белки, их экспрессии в клетках-хозяевах и антител против указанных белков.В заявке на выдачу патента Израиля 103052 описывается и заявляется растворимый рецепторный белок интерферона-ос с молекулярной массой около 45000 Да, выявленный по методу вестерн-блоттинга с помощью моноклональных антител против рецептора интерферона-а. В указанной заявке описывается и заявляется также другой растворимый связывающий интерферон-ос белок, имеющий молекулярную массу около 40000 Да, который выявили с помощью связывания с 1251-1 Ы-оъ 2 и иммуноосаждением с помощью анти-ШЫ-а моноклональных антител. Если их выделяют из сыворотки крови, то указанные соединения имеют молекулярную массу 50 кДа. В заявке на выдачу патента Израиля 106591 описывается и заявляется указанный выше интерферон-оъ-связывающий белок с молекулярной массой 40000 Да(далее обозначается ЧРМАВ-ВР или ЧРЫАВ-ВРП), которьпй выделяется из мочи в гомогенном виде и имеет последовательность, которая отличается от любого известного белка. РЫАВ-ВР связывает и блокирует активность различных подтипов интерферона-а, а также интерферона-В. По этой причине характеристики связывания ШЫАВ-ВР значительно отличаются от ранее описанных рецепторов интерферона на поверхности клеток, которые соответствуют лишь интерферону-цв человека.В соответствии с настоящим изобретением две комплементарные молекулы ДНК(кДНК), кодирующие предшественники ШМАВ-ВР, клонируют и определяют последовательность их аминокислотных остатков. Вероятно, обе они получаются из одного и того же гена, например, путем альтернативного сплайсинга. Описывается также продуцирование двух рекомбинантных белков, обозначаемых 1 РМАВ-ВР 1 и ШРМАВ-ВРП, в клетках млекопитающих и других клетках-хозяевах. Заявляются также поликлональные и моноклональные антитела, направленные против ШМАВ-ВР,применимые для блокирования рецептора интерферона, для проведения иммуноанализов И иммуноочистки 1 РМАВ-ВР 1 и ШМАВ-ВРП.1 РМАВ-ВР 1 и ШМАВ-ВРП способны модулировать активность интерферонов типа 1, т.е. различных подтипов интерферона-а, а также интерферона-В. Таким образом, ОНИ МОГУТ подавлять НСЖСЛЗТСЛЬНОС ВОЗДСЙСТВИС интерферонов типа 1.Интерфероны типа 1 (ШК-а, ШМ-В И ШЫ-ш) составляют семейство близких по своей структуре цитокинов, которые обычно выделяют по их способности придавать устойчивость к вирусньпи инфекциям. Сообщалось о разнообразной биологической активности интерферонов типа 1, включая подавление пролиферации клеток, индукцию антигенов МНС класса 1 и некоторых других иммунорегулирующих активностях 1. Интерферон-а И интерферон-В применимы для лечения различных вирусных заболеваний, в том числе гепатита С 2, 3 и бородавок 4, 5, а также некоторых злокачественных заболеваний, таких как волосато-клеточньпй лейкоз б, хронический злокачественный лейкоз 7 и саркома Калоши 8.Интерферон-а был обнаружен в сыворотках различных пациентов, страдающих аутошимунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка 9, а также больных СПИДом 1 О. Интерферон-а принимает участие в развитии ювенильного диабета 11. Кроме того, сообщалось, что повышенная экспрессия интерферона-а в белом веществе микроглии может вносить вклад в патологию болезни Альцгеймера. Далее, бьшо показано, что терапия с использованием интерферона-а приводит в ряде случаев к нежелательным побочным эффектам, в том числе к лихорадке и неврологическим заболеваниям 12. Следовательно, существуют патологические состояния, в которых нейтрализация активности интерферона может принести пользу пациенту.Как и в случае других цитокинов, интерферон-а проявляет свою биологическую активность путем связывания на поверхности клетки с рецептором, которьпй является специфическим для всех подтипов интерферона-а, а также для интерферона-В 13. Рецептор интерферона-ц человека (ШМАК) был идентифицирован и клонирован из клеток Дауди 14. Клонированный рецептор имеет одну трансмембранную область,внеклеточную и внутриклеточную область. При экспрессии в мышиных клетках указанный рецептор придает восприимчивость по отношению к интерферону-ц человека, однако оказывает незначительное воздействие по отношеншо к другим видам интерферона-а и интерферона-В, указывая на то, что в реакции на воздействие интерферона-а и различных подтипов интерферона-В могут принимать участиеВ других исследованиях ПОКЗЗЗНО, ЧТО ДОПОЛНИТСЛЬНЫЗ КОМПОНСНТЫ ИЛИ17. Более того, сообщалось, что уже описанный рецептор 14 принимает участие всвязывании всех видов интерферона-ос И интерферона-В 18.СВЯЗЫВШОЩИе цитокины белки (растворимые рецепторы цитокинов) соответствуют областям связывания внеклеточного лиганда соответствующих рецепторов цитокина на поверхности клетки. Их получают либо альтернативным сплайсингом Пре-МРНК, общей для рецептора на поверхности клетки, либо протеолитическим расщеплением рецептора на поверхности клетки. Подобные растворимые рецепторы ранее были описаны, в том числе среди прочих растворимые рецепторы ЕЬ-б и ШЫ-у 19-21, ТМР 22-24, 1 Ь-1 25-27, 1 Ь-4 25 28, 1 Ь-2 29, 30,П-7 31 и ШМ-а 32.В настоящем изобретении заявляются молекулы ДНК, кодирующие известные ШЫ-оъ/З-связьтвающие белки (1 Ь 1 О 6591). Указанные молекулы ДНК на самом деле кодируют два различных белка, 1 РМАВ-ВР 1 и РЫАВ-ВРП, получаемые, вероятно, от одинаковой пре-мРНК путем альтернативного сплайсинга, который приводит к образованию двух молекул мРНК, одна из которых имеет размер приблизительно 1,5 тыс. нуклеотидов, а другая имеет размер приблизительно 4,5 тыс. нуклеотидов, при этом каждая из них кодирует один из связывающих белков - мРНК размером 1,5 тыс. нуклеотидов, кодирует 1 РМАВ-ВР 1, а МРНК размером 4,5 тыс. нуклеотидов кодирует ШМАВ-ВРП. Термин ПЧЧАВ-ВР относится как к 1 РМАВ-ВР 1, так и к ШМАВ-ВРП. ШЫАВ-ВР, выделенный из мочи, идентифицирован как ШМАВ-ВРП.Таким образом, в настоящем изобретении заявляется молекула ДНК, кодирующая ШМ-а/В-связывающие белки, выбранные из 1 РЫАВ-ВР 1, ШМАВ-ВРП, слитых белков и мутеинов 1 РЫАВ-ВР 1 И ШРМАВ-ВРП, их функциональных производных и их активных фракций.В изобретении также заявляются реплицируемые экспрессирующие векторы,включающие указанные молекулы ДНК, трансформированные с их помощью клеткихозяева и белки, продуцированные указанными трансформированными клеткамихозяевами. Термин молекулы ДНК включает геномные ДНК, комплементарные ДНК,синтетические ДНК и их комбинации.Изобретение относится также к молекулам ДНК, которые гибридизуются вжестких условиях с указанными выше молекулами ДНК и кодируют белки, обладающие той же биологической активностью, что и молекулы ШМАВ-ВР.В настоящем изобретении заявляются также способы получения функционально активных РМАВ-ВР и ШМАВ-ВРП, слитых белков, мутеинов или их активных фракций в клетках-хозяевах, способных их продуцировать.В настоящем изобретении заявляются также рекомбинантные КРМАВ-ВИ и ШЫАВ-ВРП, слитые белки, мутеины или их активные фракции, а также соли всех указанных соединений и фармацевтические композиции, содержащие 1 РЫАВ-ВР 1 или ШЫАВ-ВРП, слитые белки, мутеины, их активные фракции, а также соли указанных соединений.ПЧЧАВ-ВР и РЫАВ-ВРП подавляют биологическую активность природных лейкоцитов человека и интерферонов фибробластов, а также рекомбинантных интерферонов 1 РМ-а 2, ШМ-аВ, ЕРЫ-аС и ЕМ-В человека. РЫАВ-ВРХ соответствует новому трансмембранному белку, который является лиганд-связывающим рецептором РМ-а/В. ШМАВ-ВРП представляет собой растворимый рецептор, который в основномНа фиг.1 показана стратегия клонирования 1 РЫАВ-ВР 1 и ЕРЫАВ-ВРН(А) Средний ряд Последовательность внутреннего СМВг пептидаВерхний и средний ряды синтетические смысловые (вверху) и антисмысловые(внизу), генетически вырожденные олигонуклеотиды, полученные на основе пептидной последовательности и используемые для обратной транскрипции (лишь антисмысловой праймер) и для полимеразной цепной реакции (РСК).(В) Гель-электрофорез в агарозе продуктов РСК, полученных с использованием указанных выше смысловых и антисмысловых праймеров. Для генерирования кДНК играющей роль матрицы в РСК, используют следующие молекулы РНК и пратшерьт(1) Подш АРНК клеток Дауди, антисмысловой праймер. (2) Полн АРНК клеток Дауди, олиго-1(Т) праймер. (3) Общая РНК клеток Ш 3 Н антисмысловой праймер. Размер (т.п.н.) ДНКмаркеров приведен в левой части.(С) Верхний ряд Невырожденная часть последовательности, полученной изклонов рвшезсгйрс продукта РСК с размером 101 т.п.н.