Способы получения ДНКазы, ДНКаза человека, фармацевтическая композиция

2. Способ получения очищенной человеческой ДНКазь 1, дезаминированной в аминокислотном остатке, соответствующем Азп в положении 74, из нативной человеческой ДНКазЫ или ее варианта, либо очищенной человеческой ДНКазЫ, недезаминированной в указанном аминокислотном остатке или ее варианта, отличающийся тем, что смесь дезаминированной и недезаминированной человеческой ДНКазЫ разделяют с помощью смолы с иммобилизованным гепарином с последующей идентификацией форм ДНКазь 1.3. Способ получения очищенной человеческой ДНКазь 1, дезаминированной в аминокислотном остатке, соответствующем Азп в положении 74, из нативной человеческой ДНКазЫ или ее варианта, либо очищенной человеческой ДНКазЫ, недезаминированной в указанном аминокислотном остатке или ее варианта, отличающийся тем, что смесь дезаминированной и недезаминированной человеческой ДНКазЫ разделяют с помощью смолы с иммобилизованным негидролизуемым аналогом ДНК с последующей идентификацией форм ДНКазь 1.4. Очищенная недезаминированная человеческая ДНКаза, представленная аминокислотной последовательностью из нативной человеческой ДНКазЫ или ее варианта, обладающая гидролизующей ДНК активностью, отличающаяся тем, что остаток Азп, соответствующий Азп в положении 74 из нативной человеческой ДНКазЫ, является недезаминированным и, что она в основном свободна от ДНКазЫ, дезаьшнированной в данном остатке.5. Композиция ДНКазЫ, включающая очищенную недезаминированную человеческую ДНКазу по п. 4, где соответствующая дезаминированная человеческая ДНКаза содержится в количестве не более 25 мас. от всего количества ДНКазЫ в данной композиции.6. Композиция ДНКазЫ по п. 5, отличающаяся тем, что дезаминированная человеческая ДНКаза содержится в количестве не более 5 мас. от всего количества ДНКазЫ в данной композиции.7. Композиция ДНКазЫ по п. 5, отличающаяся тем, что дезаминированная человеческая ДНКаза содержится в количестве не более 1 мас. от всего количества ДНКазЫ в данной композиции.8. Очищенная дезаминированная человеческая ДНКаза, представленная аминокислотной последовательностью из нативной человеческой ДЪЩазы или ее варианта, обладающая гидролизующей ДНК активностью, отличающаяся тем, что остаток Азп, соответствующий Азп в положении 74 из нативной человеческой ДНКазЫ, является дезаминированным и, что она в основном свободна от ДНКазЫ, недезаминированной в данном остатке.9. Фармацевтическая композиция, обладающая энзиматической активностью, содержащая терапевтически эффективное количество активного вещества и наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит недезаминированную человеческую ДНКазу по п. 4.10. Фармацевтическая композиция, обладающая энзиматической активностью, содержащая терапевтически эффективное количество активного вещества и наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит дезаминированную человеческую ДНКазу по п. 8.Настоящее изобретение относится к результатам, полученным при исследовании дезоксирибонуклеазы (ДНКазщ-фосфодиэстеразы, способной проводить гидролиз полидезоксирибонуклеиновой кислоты. Оно относится в основном к разделению нескольких форд упомянутой ДНКазы к таким ее формам, на основе которых могут быть составлены полезные лекарственные композиции, а также к способам использования ДНКаз и созданных на их основе композиций.ДНКаза представляет собой фосфодйэстеразу, способную гидролизовать полидезоксирибонуклеиновую кислоту. ДНКаза была очищена из различных источников с различной степенью чистоты, Впервые полная аминокислотная последовательность для ДНКазЫ из млекопитающих была определена в 1973 т. См. Ьйао, е а 1. 1. В 1 о 1.С 11 еш. 2481489 (1973).ДНКаза характеризуется множеством уже известных полезных свойств и применялась в связи с этим для лечебных Целей. Основное терапевтическое применение ДНКазЫ связывалось со способностью снижать вязкоупругость легочных выделений при таких заболеваниях, как пневмония и муковисцидоз, что способствовало очищению дыхательных путей. См. Ьопгепсо ет а 1. АгсЬ. Шкет. Мес 1. 1422299ДНК, кодирующая ДНКазу человека, была выделена И секвенирована, при этом была достигнута экспрессия ДНК в рекомбинантных клетках, что открывало возможности получения человеческой ДНКазЫ человека в коммерчески значимых количествах. См. 11 а 1 е а 1., Ргос. Мат. Асас 1. Зсй. 8719188 - 9192 (1990). РекомбинантныеДНКазЫ ЧСЛОВСКЗ оказались ПОЛВЗНЬЦИИ В терапевтическом ОТНОШЕНИИ, ОСООСННО ПрИИСПОЛЬЗОВЗНИИ В ОЧИЩСННОМ ВИДС, КОГДЗ ее ОСВОбОЖДЗЛИ ОТ ПрОТСЗЗ И ДруГИХ бСЛКОВ,В публикации международной заявки на патент М ХУО 90/07572 описаны способы и методики получения человеческой ДНКазы в фармацевтически приемлемой форме. Существующий уровень техники располагает различными специфическими методами очистки ДНКазы. См. Кпоиш е а 1. 11.5. Ратет Мо 4065355 (опубликован 27 декабря 1977) МагКеу, РЕВЗ Ьепегэ 167155 (1984) Ме 131 у е а 1. Еиг. 1. В 1 ос 11 ет 179(1989).Несмотря на то, что вышеуказанная заявка на патент была зарегистрирована,ДНКаза-содержащий продукт, полученный из культуры рекомбинантных хозяйских клеток, в типичном случае включает в себя смесь дезаминированной и недезаминированной форм ДНКазы. Существование дезаминироваяных форм ДНКазы оставалось незамеченным явлением, несмотря на то, что было известно, что в некоторых белках имеет место дезаминирование аспарагиновых и глутаминовых остатков. См. Ейррег е а 1. Апп, Кеу. Р 11 у 1 о 1. 502333 (1988), Коззйакой, Бсйепсе 240191В настоящем изобретении утверждается на основании неотмечавшегося ранее факта, что рекомбинантная человеческая ДНКаза может существовать в виде смеси дезаминированной и недезаминированной форм с использованием методов настоящего изобретения было показано, что дезаминированная человеческая ДНКаза отличается меньшей энзиматической активностью, чем недезшиинированная человеческая ДНКаза. Таким образом, совместное присутствие в смеси дезаминириванной и недезаминированной форм ДНКазы, а также возможность осуществления дальнейшегодезаминирования ПрОДУКТЗ, КОТОРОЕ, как бЫЛО показано, ИМССТ МССТО ПРИ хранениипрепаратов человеческой ДНКазы 111 убито, может усложнить получение устойчивыходнородных препаратов ДНКазы, пригодных для клинического применения. Исходя из этого, поскольку само существование, а тем более характеристики дезаминированной ДНКазы до настоящего изобретения оставались неизвестными, в данном изобретении приведены методы идентификации дезаминированности ДНКазы, а также способы отделения таких ДНКаз от препаратов ДНКазы, в которых дезаминированная ДНКаза могла быть найдена, однако ее присутствие неочевидно.Таким образом, объектом изобретения являются способы получения очищеннойсоответствующем Азп в положении 74, из нативной человеческой ДНКазы или ее варианта, либо очищенной человеческой ДНКазы, недезаминированной в указанном аминокислотном остатке или ее варианта. По первому варианту способа смесь дезаминированной и недезаминированной человеческой ДНКазы разделяют с помощью ворсистой катионообменной смолы с последующей идентификацией форм ДНКазы.По второму варианту способа смесь дезаминированной и недезаминированной человеческой ДНКазы разделяют с помощью смолы с иммобилизованным гепарином споследующей идентификацией форм ДНКазы.человеческой ДНКзы разделяют с помощью смолы с иммобилизованным негидролизуемым аналогом ДНК с последующей идентификацией форм ДНКазы.Объектом изобретения является также очищенная недезаминированная человеческая ДНКаза, представленная аминокислотной последовательностью из нативной человеческой ДНКазы или ее варианта, обладающая гидролизующей ДНК активностью, в которй остаток Азп. соответствующий Азн в положении 74 из нативной человеческой ДНКазы, является недезаминированным и которая в основном свободна от ДНКазы, дезаминированной в данном остатке.Еще одним объектом изобретения является композиция ДНКазы, включающая очищенную недезаминированную человеческую ДНКазу по изобретению, где соответствующая дезаминированная человеческая ДНКаза содержится в количестве не более 25 мас., предпочтительно не более 5 мас. от всего количества ДНКазы в данной композиции, еще более предпочтительно не более 1 мас. от всего количества ДНКазы в данной композиции.Объектом изобретения является также очищенная дезаминированная человеческая ДНКаза, представленная аминокислотной последовательностью из нативной человеческой ДНКазы или ее варианта, обладающая гидролизующей ДНК активностью, в которой остаток Азп, соответствующий Азп в положении 74 из нативной человеческой ДНКазы, является дезаминированным и которая в основном свободна от ДНКазы, недезаминированной в данном остатке.Еще одним объектом изобретения является фармацевтическая композиция,обладающая энзиматической активностью, содержащая терапевтически эффективное количество активного вещества и наполнитель, причем в качестве активного вещества она содержит недезаминированную человеческую ДНКазу по изобретению.Объектом изобретения является также фармацевтическая композиция, 5