Химерные аденовирусы для использования при лечении рака

11. Аденовирус по п. 10, отличающийся тем, что удалены участки Е 1 и ЕЗ.12. Аденовирус по п. 11, отличающийся тем, что дополнительно удален участок Е 4.13. Аденовирус по п. 10, отличающийся тем, что его геном дополнительно содержит гетерологичный ген, кодирующий тимидинкиназу или терапевтический белок, при этом гетерологичньпй ген экспрессируется в клетке, инфицированной указанным аденовирусом.14. Аденовирус по п. 13, отличающийся тем, что гетерологичный ген кодирует тимидинкиназу.15. Аденовирус по п. 13, отличающийся тем, что терапевтический белок выбран из группы, включающей цитокины, хемокины, антитела, ферменты, активаторы пролекарств и иммунорегуляторные белки.Настоящее изобретение шест приоритет предварительной заявки на патент ИЗ 60/574,851,поданной 26 мая 2004 года, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.Злокачественные новообразования являются основной причиной смертности как в США, так и в других странах мира. В зависимости от типа злокачественного новообразования для лечения обычно применяют хирургические методы, химиотерапию и/или лучевую терапию. Часто эти методы являются неэффективными и, следовательно, существует необходимость новых видов лечения, которые могут использоваться отдельно или в комбинации с классическими методами.Одним из подходов является применение аденовирусов, отдельно или в качестве векторов, способных доставлять противораковые терапевтические белки к опухолевым клеткам. Аденовирусы представляют собой безоболочечные икосаэдрические вирусы с двухцепочечной молекулой ДНК, линейный геном которых содержит около 36 тыс. пар оснований. На каждом конце вирусного генома присутствует короткая последовательность, известная как инвертированный концевой повтор (или 1 ТК), которая необходима для репликации вируса. Геномы всех аденовирусов человека, исследованных к настоящему времени, имеют одинаковую общую организацию то есть гены, кодирующие специфические функции, расположены в одном и том же положении вирусного генома. Вирусный геном содержит пять ранних единиц транскрипции (Е 1 А, Е 1 В Е 2, Е 3 и Е 4), две отсроченно-ранние единицы (1 Х и 1 уа 2) и одну позднюю единицу (главную позднюю), что приводит к образованию пяти семейств поздних мРНК (Ы-ЬЗ). Белки, кодируемые ранними генами, вовлечены в репликацию, тогда как поздние гены кодируют вирусные структурные белки. Части вирусного генома легко могут быть замещены с помощью ДНК чужеродного происхождения, и такие рекомбинантные аденовирусы являются структурно стабильными, а свойства, приобретаемые такими вирусами, потенциально делают их пригодными для генной терапии .То 11 у В. (1994) Саисег Сене ТЬегару 151-64.В настоящее время попытки исследователей получить аденовирусы, пригодные для лечения, сосредоточены на серотипе аденовируса А 15. Генетика этого аденовируса человека хорошо изучена, также описаны системы для его молекулярной манипуляции. Для поддержки клинического применения разработаны высокоэффективные способы получения и доступные некоторые опыты использования этого агента в клинике .1 о 11 у, 13. (1994) Сансег Сене ТЬегару, 151-64. Исследования, относящиеся к применению аденовирусов человека (Ас 1) для лечения злокачественного новообразования, сконцентрированы на разработке аденовирусов на основе Ас 15, которые являются особенно эффективными или предпочтительно нацелены на специфические типы опухолевых клеток и существует потребность получения более эффективных онколитических вирусов для того, чтобы лечение с помощью аденовирусов нашло практическое применение в клинических условиях.Ас 15 является только одним из 51 известных в настоящее время аденовирусных серотипов, которые подразделяются на подгруппы А-Р на основе различных характерных признаков, включая их гемагглютинирующие свойства Ьеп 1, Абепоуйгйбае ТЬе Уйшзез апа тлен Кернсатйоп, в Р 1 е 115 У 1 го 1 о 3 у, том 2, 4-е издание, Кпйре, еа., Ырршсоп, Шшйаппз У 1111 п 5. - Р. 2265-2267 (2001). Эти серотипы отличаются на различных уровнях, например, патологией, вызываемой у людей и грызунов, клеточными рецепторами, используемыми для прикрепления, но эти отличия в значительной степени игнорируются в качестве эффективных средств развития более сильнодействующих онколитических аденовирусов(за Исключением изменений волокон жеуепзоп и др. (1997) 1. /1 го 1. 7124782-4790 Кгазпуки и др. (1996) 1. У 1 го 1. 7 О 6839-6846 Шйскпаш и др. (1997) 1. 71 го 1. 7118221-8229 Ье 3 гапс 1 и др. (2002) Сшт. Оепе Т 11 ег. 22323-329 Вашей и др. (2 ОО 2)В 1 осЫт. Вйорпув. Аста 131-14 заявка на патент ИЗ 2003/0017138.Использование различий между серотипами аденовирусов может обеспечивать источник более эффективных лекарственных средств на основе аденовирусов при использовании новых аденовирусов с повышенной селективностью и активностью. Существует потребность в таком улучшенном лечении на основе аденовирусов.Настоящее изобретение обеспечивает новые химерные аденовирусы или их варианты или производные, пригодные для лечения с использованием вирусов. В частности, изобретение обеспечивает химерные аденовирусы или их варианты или производные, имеющие геном, содержащий участок Е 2 В, гдеуказанный участок Е 2 В содержит нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение от первого аденовирусного серотипа, и нуклеотидную последовательность,имеющую происхождение от второго аденовирусного серотипауказанные первый и второй аденовирусные серотипы (каждый) выбираются из подгрупп аденовирусов В, С, В, Е или Р и отличаются ДРУГ от друга,и указанный химерный аденовирус является онколитическим и проявляет повышенный терапевтический индекс в опухолевой клетке.В одном варианте осуществления изобретения химерный аденовирус дополнительно содержит участки, кодирующие фибриллярные, гексоновые и пентоновые белки, где нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки, получены из одного И того же аденовирусного серотипа. В другом варианте осуществления изобретения химерный аденовирус по изобретению содержит модифицированный участок Е 3 или Е 4.В другом варианте осуществления изобретения, химерный аденовирус проявляет повышенный терапевтический индекс в опухолевых клетках ободочной кшшси, молочной железы, поджелудочной железы, легких, предстательной железы, яичника или опухолевых кроветворных клетках. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения химерный аденовирус проявляет повышенный терапевтический индекс в опухолевых клетках ободочной кишки.В предпочтительном варианте осуществления изобретения участок Е 2 В химерного аденовируса содержит БЕО П) ЪЮЗ. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения химерный аденовирус содержит ЗЕО 113 МО 1.Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный химерный аденовирус или его вариант или производное, имеющий геном, содержащий участок Е 2 В, гдеуказанный участок Е 2 В содержит нуклеотидные последовательности, имеющие происхождение от первого аденовирусного серотипа, и вторую нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение от второго аденовирусного серотипауказанные первый и второй аденовирусные серотипы (каждый) выбираются из подгрупп аденовирусов В, С, В, Е, или Р и отличаются ДРУГ от дРУгауказанный химерный аденовирус является онколитическим и проявляет повышенный терапевтический индекс в опухолевой клеткеи указанному химерному аденовирусу придавали недостаточность репликации путем удаления одного или более аденовирусных участков, кодирующих белки, вовлеченные в репликацию аденовируса, выбранные из группы, включающей Е 1, Е 2, Е 3 или Е 4.В одном варианте осуществления изобретения химерный аденовирус по изобретению дополнительно содержит гетерологичный ген, который кодирует терапевтический белок,где указанный гетерологичный ген экспрессируется в клетке, инфицированной указанным аденовирусом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения терапевтический белок выбирают из группы, включающей цитокины и хемокины, антитела, ферменты, превращающие пролекарства, и иммунорегуляторные белки.Настоящее изобретение обеспечивает способы применения химерных аденовирусов по изобретению для терапевтических целей. В одном варианте осуществления изобретения химерные аденовирусы могут применяться для ингибирования роста злокачественных клеток. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химерный аденовирус,содержащий ЗЕО П) МОЛ, пригоден для ингибирования роста злокачественных клеток ободочной кишки.В другом варианте осуществления изобретения аденовирусы по изобретению пригодны в качестве векторов для доставки терапевтических белков в клетки.Настоящее изобретение обеспечивает способ получения химерных аденовирусов по изобретению, который предусматриваета) объединение аденовирусных серотипов, представляющих подгруппы аденовирусов В-Р, таким образом получая смесь аденовирусовб) пассирование объединенной смеси аденовирусов со стадии (а) в активно растущей культуре опухолевых клеток при соотношении частичек на клетку, достаточно большом для стимуляции рекомбинации между серотипами, но не настолько большом, чтобы вызывать преждевременную гибель клетокв) сбор супернатанта со стадии (б)г) инфицирование покоящейся культуры опухолевых клеток супернатантом, собранным на стадии (в)д) сбор супернатанта клеточной культуры со стадии (г) до появления любых признаков СРЕе) инфицирование покоящейся культуры опухолевых клеток супернатантом, собранным на стадии (д) из) выделение химерного аденовируса из супернатанта, собранного на стадии (е), путем очистки бляшки.Фиг. 1. Профили времени удерживания Ас 1 на ВЭЖХ-колонке ТМАЕ. А) Профили удерживания для отдельных серотипов Ад, используемых для получения оригинального исходного вирусного пула. Б) Профили удерживания пулов 20 пассажа, имеющих происхождение от клеточных линий НТ-29, Ранс-1, МВА-231 и РС-3 соответственно.Фиг. 2. Цитолитическая активность отдельных вирусных пулов. А) НТ-29 Б) МПА-231 В) Рапс-1 и Г) РС-3 клетки инфицировали их соответствующими вирусными пулами при УР на соотношение клеток от 100 до 0,01. В различные/дни после инфицирования проводили МТБ-исследования (как указано), в зависимости от клеточной линии Каждая точка данных на панели представляет собой исследование, осуществленное в четырех повторах,результаты выражали в виде средних значений ЬСО. На панели приведен один характерный пример, и все вирусные пулы исследовали по меньшей мере три независимых раза на целевой клеточной опухолевой лшнии (обозначения на фигуре оАс 15 -Писходный вирусный пул ппул, имеющий происхождение от специфических клеток, пассаж 20).Фиг. 3. Цитолитическая активность Со 1 оАс 11 и А 15 на клеточных линиях опухолей человека. МТЗ-анализ осуществляли на А) широкой панели клеточных линий опухолей че 4ловека и Б) на панели клеточных линий рака ободочной кишки человека для определения возможной специфической активности. МТБ-анализ осуществляли в различные дни в зависимости от клеточной линии. Каждая панель представляет собой типичный эксперимент, который повторяли по меньшей мере три раза. Каждая точка данных на панели представляет собой исследование, осуществленное в четырех повторах, результаты выражали в виде средних значений СО (обозначения на фигуре --Ас 15 П-Со 1 оА 11).Фиг. 4. Цитолитическая активность Со 1 оАс 11 и А 15 на панели нормальных клеток. Клетки НЗ-27, НПУЕС и АЕС (первичные фибробластные, эндотелиальные и эпителиальные клетки соответственно) инфицировали Со 1 оА 11 И А 15 при /Р на соотношение клеток от 100 до 0,01. МТЗ-анализ осуществляли в различные дни в зависимости от клетки,и каждая панель представляет собой типичный эксперимент, который повторяли по меньшей мере три раза. Каждая точка данных на панели представляет собой исследование,осуществленное в четырех повторах, результаты выражали в виде средних значений СО(обозначения на фигуре оАс 15 П-Со 1 оА 11).Фиг. 5. Цитолитическая активность Со 1 оА 11 Ас 15 и ОЫУХ-О 15 на первичных нормальных эндотелиальных клетках (НПУЕС) и клеточной линии опухоли ободочной кишки(НТ-29). Каждая панель представляет собой типичный эксперимент, который повторялш по меньшей мере три раза. Каждая точка данных на панели представляет собой исследование, осуществленное в четырех повторах, результаты выражали в виде средних значений СО (обозначения на фигуре -А 15 ПСо 1 оАс 11 п-Опух-015).Фиг. 6. Цитолитическая активность Со 1 оАс 11, Ас 111 р и Ас 15 на нормальной эпителиальной клеточной линии (ЗАЕС) и клеточной линии рака ободочной кишки человека (НТ-29). Каждая панель представляет собой типичный эксперимент, который повтряли по меньшей мере три раза. Каждая точка данных на панели представляет собой исследование,осуществленное в четырех повторах, результаты выражали в виде средних значений фСО(обозначения на фигуре оА 15 ПА 11 1 р пСо 1 оАс 11).Фиг. 7. Цитолитическая активность рекомбинантных вирусов. конструировали рекомбинантные вирусы, представляющие четыре вирусные популяции (Ас 1 р 1 1, Со 1 оАс 11, левый конец Ас 111 р/правьп 7 т конец Со 1 оАс 11(Со 1 оА 11.1) и левый конец Со 1 оАс 11 / правый конец Ас 111 р (Со 1 оАс 11.2, как описано в примере 6. Определяли цитолитическую активность каждой популяции в НТ 29 клетках, как было описано ранее. (Обозначения на фигуре ь-А 15 П-АЩ 1 р пСо 1 оА 11 о Со 1 оАс 11 1 АСо 1 оА 11.2).Все публикации, включая патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящее изобретение в качестве ссылки в таком объеме, если бы каждая отдельная публикация была специфически и отдельно полностью включена в качестве ссылки.Если специально не указано иначе, то все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют такие же значения, какие обычно подразумеваются средним специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Как правило, номенклатура, используемая в настоящем изобретении, и лабораторные методики, описанные ниже, являются хорошо известными и обычно используемыми в данной области.Как используется в настоящем изобретении, термин аденовирус, серотип или аденовирусный серотип относится к любому из 51 аденовирусных серотипов человека, известных в настоящее время или выделенных в будущем Зггаизщ Ааепоуйгиз йпгесйопз 111 Ьитапз, Т 1 те Адепоуйгизез, Ойпзьега, еа., Р 1 епит Ргезз, Нью-Йорк, НУ. - Р. 451-596 (1984). Эти серотипы классифицируют на подгруппы А-Р 11 еп 1 Ааепоуйгйбае ТЬе Шгизез аш Т 11 е 1 г Керйсайоп, Р 1 е 11 Уйгоюду, том 2, 4-ое издание, Кпйре, еа., Ыррйпсоп Ж/Шйашз Шкив. - Р. 2265-2267 (20 О 1), как показано в таблице.