Новые цитохром Р450-монооксигеназы и их применение для окисления органических соединений

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что окисление соединения в среде с цитохром Р 450-монооксигеназой проводят в присутствии кислорода при температуре примерно от 20 до 40 С И значении рН примерно от 6 до 9, причем среда содержит по отношению к окисляемому соединению примерно 10-100-кратный молярный избыток восстановительных эквивалентов.4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что проводят окисление соединения, выбранного из индола, 1-метилиндола, 5-хлор- или броминдола, индена, бензотиофена, акридина,6-метил- или 8-метилхинолина, хинолина или хинальдина.5. Способ микробиологического окисления соединения, выбранного из группы, включающей незамешенные или замещенные одно- или многоядерные ароматические углеводороды, линейные или разветвленные алканы или алкены и незамещенные или замещенные циклоалканы или циклоалкены, отличающийся тем, чтоа) указанное соединение инкубируют в среде с цитохром Р 450-монооксигеназой или в среде с рекомбинантным микроорганизмом, производящим Цитохром Р 45 О-монооксигеназуЬ) выделяют из среды образовавшийся продукт окисления или его производный продукт,причем указанная цитохром Р 450-монооксигеназа является производной от цитохром Р 450-монооксигена 3 ы ВМ-3 из Васшиз шеватегйит с аминокислотной последовательностью, представленной в виде ЗЕО П) 11 О 2, которая имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в области аминокислотной последовательности 86-88 И, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 73-82 или 172-224 и, при необходимости, дополнительно имеет одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 39-43, 48-52,67-70, 330-335 или 352-356.6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что используют Цитохром Р 45 О-монооксигеназу, имеющую, по меньшей мере, следующие одно- или многократные замещения аминокислот7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что окисление соединения в среде с ЦИтохром Р 45 О-монооксигеназой проводят в присутствии кислорода при температуре примерно от 20 до 40 С и значении рН примерно от 6 до 9, причем среда содержит по отношению к окисляемому соединению примерно 10-1 ОО-кратный молярный избыток восстановительных эквивалентов.8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что проводят окисление соединения, выбранного из н-гексана, н-октана, н-декана, н-додекана, кумола, оъ-, В- и у-ионона или нафтаЛИНЗ.9. Способ микробиологического производства индиго и/или индирубина, отличающийся тем, чтоа) инкубируют индол в среде с Цитохром Р 450-монооксигена 3 ой или в среде с рекомбинантным микроорганизмом, производящим цитохром Р 45 О-монооксигеназу, который также способен образовывать индол в качестве промежуточного продуктаЬ) выделяют из среды образовавшийся индиго и/или индирубин,причем указанная цитохром Р 45 О-монооксигеназа является производной от цитохром Р 450-монооксигеназы ВМ-3 из Васшиз шеагегйнш с аминокислотной последовательностью, представленной в виде ЗЕО П) 1 Ю 2, которая имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в области аминокислотной последовательности 86-88 и, по меньшеймере, одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последова 2тельности 73-82 или 172-224 и, при необходимости, Дополнительно имеет одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 39-43, 48-52,67-70, 330-335 или 352-356.10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что окисление индола проводят путем культивирования микроорганизма в среде в присутствии кислорода при температуре примерно от 20 до 40 С и значении рН от 6 до 9.11. Способ по п. 9 или 10, отличающийся тем, что используют Цитохром Р 45 Омонооксигеназу, имеющую, по меньшей мере, следующие одно- или многократные замещения аминокислот12. Цитохром Р 450-монооксигеназа, которая способна, по меньшей мере, к одной из следующих реакцийа) окисление незамещенного или замещенного М-, О- или З-гетероциклического одно-,двух- или многоядерного ароматического соединенияЬ) окисление незамешенного или замещенного одно- или многоядерного ароматического углеводородас) окисление линейного или разветвленного алкана или алкена и(1) окисление незамещенного или замещенного циклоалкана или циклоалкена,причем указанная цитохром Р 450-монооксигеназа является производной от цитохром Р 450-монооксигена 3 ь 1 ВМ-3 из Вас 111 и шедатегйиш с аминокислотной последовательностью согласно БЕО 113 МО 2, которая имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в области аминокислотной последовательности 86-88 и, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 7382 или 172-224 и, при необходимости, дополнительно имеет одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 39-43, 48-52, 67-70, 330-335 или 352-356.13. Цитохром Р 450-монооксигеназа по п. 12, отличающаяся тем, что она имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в области аминокислотной последовательности 86-88 и имеет, по меньшей мере, одну функциональную мутацию в одной из областей аминокислотной последовательности 73-82 или 172-224.а) Р 11 е 87/а 1 И Ьеи 1 886111 или Ь) РЬе 87/а 1, Ьеп 1 886111 и А 1 а 7461 у,или ее функциональный эквивалент, который способен, по меньшей мере, к одной из вышеуказанных реакций окисления. Приоритет установлен по пп. 1-4 - 1999.11.18, 20000322 по пп. 5-8 - 2000.03.22 по пп. 9-11 - 1999.11.18 по пп. 12-13 - 1999.07.27, 1999.11.18, 2000.03.22 по п. 14 - 1999.07.27, 2000.03.22.Настоящее изобретение касается новых цитохром Р 450-монооксигеназ с измененной специфичностью субстрата, пригодных для окисления органических субстратов, например, М-гетероциклических ароматических соединений, кодированных для этого последовательностей нуклеотидов, содержащих эту последовательность экспрессионных конструктов и векторов, и тем самым трансформированных микроорганизмов, способа микробиологического окисления различных органических субстратов, таких как М-гетероциклических ароматических соединений и, в частности, способа изготовления индиго и индирубина.Энзимы с новыми функциями и свойствами могут быть получены или путем скрининга природных проб или путем изменения белка известных энзимов. При определенных обстоятельствах последний метод может быть более предпочтительным в получении свойств, которые невероятны на пути природной селекции. Несмотря на различные попытки по созданию энзимов, до сих пор мало удачных исследований по стимулированию каталитической активности мутантов энзимов относительно определенного субстрата (1-10). В этих известных случаях субстраты структурно тесно связаны с природными субстратами соответствующего энзима. До сих пор нет сообщений об успешном создании энзимов, которые после модификации катализировали бы преобразование соединения, которое полностью отлича ется от природного субстрата энзима.Выделенная из бактерии Васттиз тедттегит цитохром Р 45 О-монооксигеназа обычно катализирует субтерминальное гидроксилирование длинноцепочечных насыщенных кислот и соответствующих амидов и спиртов из них или эпоксидирование ненасыщенных длинноцепочечных жирных кислот со средней длиной цепи (11-13). Оптимальная длина цепи насыщенных жирных кислот составляет от 14 до 16 атомов углерода. Жирные кислоты с длиной цепи менее 12 не гидроксилируются (1 1).Структура гем-домена Р 45 О ВМ-З определялась с помощью рентгеноструктурного анализа (14-16). Места связывания субстрата имеют форму длинного туннелевидного отверстия, которое от поверхности молекулы идет к гем-молекуле и ограничивается почти исключительно гидрофобными остатками аминокислот. Отдельные заряженные остатки на поверхности гем-домена являются остатками Ага 47 и Туг 51. Принимается, что они участвуют в связывании карбоксилатной группы субстрата путем образования водородной связи (14). Мутация Аг 347 к 6111 вызывает дезактивацию энзима арахидоновой кислоты (13), но повышает его активность в отношении Сш-См-соединений алкилтриметиламмиака. Использование субстрата для ароматических соединений, в частности, для одно-, двух- или полициклических, в частности, гетероциклических ароматических углеводородов, алканов, алкенов, циклоалканов и циклоалкенов относительно этого энзима не было описано. До сих пор среди специалистов было принято, что иные, чем описанные здесь органические субстраты, как, например, индол, не могут быть субстратами по причине очевидных структурных различий с природными субстратами Р 450 ВМ-З. в частности, из-за отсутствия функциональных групп, которые могли бы связывать