Способ подготовки образца ткани мозга для электронно-микроскопического исследования

(51) С 0111 1128 НАЦИОНАЛЬНЫЙ цЕНтР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦА ТКАНИ МОЗГА(71) Заявитель Учреждение Образования Гродненский государственный медицинский университет (ВУ)(72) Авторы Зиматкин Сергей Михайлович Кузнецова Вера Борисовна Кравчук Римма Ивановна (ВУ)(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет (ВУ)Способ подготовки образца ткани мозга для электронно-микроскопического исследования, заключающийся в том, что получают образец ткани, замораживают в жидком азоте,изготавливают два соседних криостатных среза толщиной 20 ц и 60 ц, криостатный срез толщиной 20 ц размораживают, подсушивают при комнатной температуре и маркируют по методу Ниссля или специфическим маркером для выявления нужных структур мозга,второй срез толщиной 60 ц в камере криостата помещают в охлажденный фиксатор, промывают и обезвоживают в спиртах с возрастающей концентрацией, затем под контролем маркированного среза в срезе толщиной 6011, предназначенном для электронно-микроскопических исследований, вырезают зону, содержащую изучаемую структуру.Ядро Е 2 в контрольном срезе гипоталамуса крысы (Р 3,80 тт). Окраска на выявление активности МАО Б. Об.х 10. Цифровая микрофотография (окраска по методу С.М. Зиматкина, В.Ф.Цыдика., 1994).ИЗОбрСТСНИС ОТНОСИТСЯ К бИОЛОГИИ, а ИМСННО К ГИСТОЛОГИИ И НСЙрОМОрфОЛОГИИ И ПОЗВОЛЯСТ исследовать МСЛКИС СТРУКТУРЫ мозга.Известен способ приготовления электронно-микроскопических препаратов (Шагзоп М.1.,51211111113 01 г 15511 е 5 есг 10115 101 е 1 есггоп 1111 сг 05 с 0 ру 91/1111 11 еауу 111 еЕа 15, 1. В 10 р 11 у 5. В 10 с 11 е 111. Суг., 1958. - /01. 4. - Р. 475-478, Кеу 110115 Е. 5., Т 11 е иве 0111210 с 1 ггаге а 111311 рН аз а 11 е 1 есггопорачие 5121111 1 п е 1 есгго 11 1111 сг 05 с 0 ру., 1. Се 11 В 101., 1963. - /01. 17. - Р. 208-212). Кусочкиоргана размером 1 Х 1 мм фиксируют в течение 2 Ч при 4 С в двух порциях 1 Оз-фиксатора на буфере Миллонига рН 7,4 (М 11101113 6., Абуапуапгез 01 а р 1105 р 11 ае ЬиГГег 101 0504 50111110115 1 п Г 1 ха 1011., 1. Арр 1. Р 11 у 51 с 5,., 1961. - /01. 32. - Р. 1637-1643.). Затем промывают 10 мин в р-ре буфера Миллонига с сахарозой. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заключают в заливочную среду (Аралдит М Аралдит Назг дибутилфталат ДМР-30). Полимеризуют при 65 С 4 суток. Срезы изготавливают на ультрамикротоме. На окрашенных метиленовым синим полутонких срезах уточняют локализацию изучаемых гистологических структур. Ультратонкие срезы контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца.Недостатком этого способа является невозможность его использования для электронно-микроскопического исследования мелких структур мозга (размером менее 0,5 мм в диаметре), так как такие мелкие структуры целенаправленно иссечь технически невозможно.Задача изобретения - разработать способ подготовки тканей для электронномикроскопических исследований мелких структур мозга.Поставленная задача решается путем получения образца ткани мозга, замораживания в жидком азоте, изготовления двух соседних криостатных срезов толщиной 20 11 и 60 11,после чего криостатный срез толщиной 20 11 размораживают, подсушивают при комнатной температуре и маркируют по методу Ниссля или специфическим маркером для вь 1 явления нужных структур мозга, второй срез толщиной 60 р. в камере криостата помещают в охлажденный фиксатор, промывают и обезвоживают в спиртах с возрастающей концентрацией, затем под контролем маркированного среза в срезе толщиной 60 11, предназначенном для электронно-микроскопических исследований, вырезают зону, содержащую изучаемую структуру.Способ осуществляют следующим образом. После декапитации животного проводят вскрытие черепной коробки, извлекают головной мозг с последующим выделением гипоталамуса. Последний, предварительно выдержав в парах азота, подвергают заморозке путем погружения в жидкий азот. После чего образец монтируют в криостате. Два среза толщиной 20 р. и 60 ц, готовят при г - 15 С на уровне Р - 3,80. Первый срез монтируют на предметное стекло, быстро расправляют и размораживают, подсушивают при комнатной температуре. Затем срез маркируют по методу Ниссля или специфическим маркером для выявления нужных структур мозга. Второй срез в камере криостата помещают в предварительно охлажденный до 4 С 1 О 5-фиксатор. После чего его извлекают из камеры криостата во флаконе с фиксатором и фиксируют в течение 2 ч при 4 С в двух порциях 1 Оз-фиксатора, приготовленного на буфере Миллонига (рН 7,4). В дальнейшем, после промывки в р-ре (буфер Миллонига (рН 7,4) (20 мл) сахароза (900 мг, проводят обезвоживание материала в 50 и 70 спиртах. Затем под контролем маркированного среза вырезают зоны, содержащие изучаемую структуру. Далее материал выдерживают ночь в холодильнике при 4 С в 2 уранилацетате на 70 спирте.Дальнейшее обезвоживание материала проводят в спиртах возрастающей концентрации, смеси ацетона и спирта, ацетоне. После обезвоживания материал заключают в заливочную смолу с предварительным проведением через смеси смолы (Аралдит М Аралдит На 5 Дибутилфталат ДМР-30) и ацетона. Срезы изготавливают на ультрамикротоме. На окрашенных метиленовым синим полутонких срезах уточняют локализацию изучаемой структуры. Ультратонкие срезы контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца. Сеточки опускают в каплю уранилацетата на 30 мин (для головного мозга) под темнойКрышкой при КТ. Промывают 5 О спиртом 3 с. Промывают в 2-х порциях бидистиллированной Н 2 О по 5 с. Контрастируют цитратом свинца 10 мин. Промывают в 3-х порциях воды по 5 с. Изучают материал в электронном микроскопе.Приводим пример, подтверждающий возможность осуществления способа.Для исследования нейронов гистаминергического ядра Е 2 гипоталамуса мозга Крысы в Качестве специфического маркера использовалась моноаминооксидаза типа Б (МАО Б). После приготовления двух срезов толщиной 20 р. и 60 р. готовят при г - 15 С на уровне Р - 3,80 первый срез, монтируют на предметное стекло, быстро расправляют и размораживают, а затем подсушивают при комнатной температуре. Маркируют первый срез на выявление МАО Б (Зиматкин С.М., Ць 1 дикВ.Ф. Гистохимический метод исследования активности моноаминооксидазы А и В в мозге // Морфология. - 1994. - Не 4-6. - С. 157161. Второй срез приготавливают способом, описанным в прототипе. Затем под Контролем маркированного среза на втором срезе вырезают зоны, содержащие нейроны гистаминергического ядра Е 2 гипоталамуса мозга крысы. Далее полученный материал выдерживают ночь в холодильнике при 4 С в 2 уранилацетате на 70 спирте, обезвоживают, заключают в заливочную смолу с предварительным проведением через смеси смолы (Аралдит М Аралдит Назг Дибутилфталат ДМР-30) и ацетона. Срезы изготавливают на ультрамикротоме. На окрашенных метиленовым синим полутонких срезах уточняют локализацию гистаминергического ядра. Ультратонкие срезы контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца. Сеточки опускают в каплю уранилацетата на 30 мин(для головного мозга) под темной крыщкой при КТ. Промывают 5 О спиртом 3 с, промь 1 вают в 2-х порциях бидистиллированной Н 2 О по 5 с, Контрастируют цитратом свинца 10 мин, промывают в 3-х порциях воды по 5 с. После чего изучают в электронном микроскопе.Для иллюстрации полученных результатов прилагаются микрофотографии маркированного среза (микрофотография Е 2 и Е 3 гистаминергических ядер гипоталамуса Крысы на уровне Р - 3,80) и электронные микрофотографии, полученные с соседнего криостатного среза, подверженного стандартному классическому способу приготовления электронно-микроскопических препаратов, описанному в прототипе (Фрагменты перикарионов нейронов гистаминергического ядра Е 2) (рис. 1, 2, 3).Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом возможность точного электронно-микроскопического исследования мелких структур мозга (менее 0,5 мм в диаметре).Способ прост, надежен, хорощо воспроизводим. Может быть использован в любой электронно-микроскопической лаборатории.Ядро Е 2 в контрольном срезе гипоталамуса крысы (Р -3.8 О тт). Окраска на вшивление активности МАО Б. 06.3440. Цифровая микрофотография.Фрагмент кштоплазмы нейрона гистаминершческого ядра Е 2. Ядро (Я). Видна ядерная оболочъа (ЯО) с порами. Митохондрии (Мх) овальной н круглой формы, преимущественно мешшх и средних размеров. Хорошо развита Гранулярная эндоплазматическая сеть (Г рЭС), мвэлщу мембранами-х ГрЭС значительное количество свободных рибосомНациональный Центр Интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.