Способ получения N?-бензоил-DL-аргинил-п-нитроанилида гидрохлорида

(51)07 237/22 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Мартинович Вера Павловна Поликарпова Валентина Ивановна Евстигнеева Елена Борисовна Чемитова Лилия Михайловна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) Методы получения химических реактивов и препаратов. - М., 1965. - Вып. 13. С. 76-79.. - .(57) Способ получения -бензоиларгинил-п-нитроанилида гидрохлорида, включающий бензоилирование -аргинина хлористым бензоилом в водно-диоксановой среде с получением -бензоиларгинина гидрохлорида, который затем подвергают взаимодействию с п-нитроанилином в диметилформамиде с добавлением пиридина до 7-8 при использовании дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента. Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины, а именно, к способу получения -бензоиларгинил-п-нитроанилида гидрохлорида (-). Это соединение представляет собой субстрат сериновых протеиназ и находит широкое применение для количественного определения их содержания и протеолитической активности, в том числе для количественного определения в плазме крови таких сериновых протеиназ и их ингибиторов, как 1-антитрипсин и 2-макроглобулин, которые определяют уровень протеолитической активности и ингибиторный потенциал крови. Известен способ получения - с использованием -бензоилнитро-аргинина и п-нитрофенилизоцианата 1. Этот способ многостадиен, так как включает стадии введения -защиты и ее отщепления, для получения п-нитрофенилизоцианата используется весьма токсичное соединение - фосген, а при отщеплении нитрогруппы применяют агрессивный и токсичный фтористый водород 1. Известны способы синтеза -, в которых используется -бензоилпроизводные аргинина без защиты гуанидиновой функции ковалентно связанными с ней 8186 1 2006.06.30 защитными группами. - был впервые получен конденсацией -бензоил-аргинина гидрохлорида с п-нитроанилином в диэтилфосфине в присутствии 85 -ной фосфорной кислоты и пятиокиси фосфора и три-п-бутиламина 2. Главным недостатком метода является использование высокотоксичного соединения фосфора - диэтилфосфина. Кроме того, при синтезе образуются еще более высокотоксичные фосфины. Разновидностью этого способа является получение - с использованием полиэфиров фосфорной кислоты, состоящее из 2 стадий - получения -бензоиларгинина гидрохлорида и получения - 3. Получение -бензоиларгинина гидрохлорида ведут в присутствии 23, полученную натриевую соль -бензоиларгинина переводят в гидрохлорид добавлением раствора соляной кислоты. - получают конденсацией -бензоиларгинина гидрохлорида с п-нитроанилином в присутствии этилового эфира полифосфорной кислоты. Это соединение не является распространенным реагентом, его необходимо получать в ходе синтеза из пятиокиси фосфора и этилового эфира в присутствии хлороформа, что удлиняет синтез на дополнительную стадию. Этиловый эфир полифосфорной кислоты и образующиеся в качестве побочных продуктов синтеза фосфорорганические соединения также являются токсичными веществами. Выходы соединений относительно невысоки и составляют 50-55 на стадии получения-бензоиларгинина гидрохлорида и 55 при получении -. Несколько п-нитроанилидов -производных аргинина получены при помощи универсального конденсирующего реагента, используемого в современной химии аминокислот и пептидов - дициклогексилкарбодиимида 4. При их синтезе гуанидиновая группа аргинина блокировалась тозильной или нитрозащитой, что приводило к увеличению числа стадий синтеза. Для получения - авторы 4 этот способ не использовали. Задачей изобретения является разработка способа синтеза -, который позволяет получить это соединение из доступных и недорогих исходных соединений при минимальном числе синтетических стадий, протекающих с высокими выходами синтезируемых продуктов. Задача решается проведением синтеза - в две стадии, первая из которых представляет собой получение -бензоиларгинина гидрохлорида путем бензоилирования -аргинина хлористым бензоилом в водно-диоксановой среде, а вторая конденсацию полученного -бензоиларгинина гидрохлорида с п-нитроанилином при использовании дициклогексилкарбодиимида в качестве конденсирующего агента. Блокирование реакционной способности гуанидиновой группы происходит здесь протонированием за счет хлористого водорода -бензоиларгинина гидрохлорида. В первой стадии синтеза используют полуторакратный избыток хлористого бензоила, который добавляют в виде диоксанового раствора к суспензии -аргинина в воде. -бензоиларгинина гидрохлорид получают с высоким выходом (91-95 ), и он не требует специальных очисток,кроме промывок и переосаждения. Стадию конденсации -бензоиларгинина гидрохлорида и п-нитроанилина проводят в диметилформамидном растворе при рН 7-8, который устанавливают добавлением к раствору -бензоиларгинина гидрохлорида нескольких капель пиридина. Реакцию проводят при комнатной температуре, дициклогексилкарбодиимид добавляют небольшими порциями в течение пяти минут. Интенсивное перемешивание реакционной смеси проводят в течение 14-16 часов при комнатной температуре. Для выделения и очистки - после отделения дициклогексилмочевины фильтрованием к диметилформамидному раствору добавляют эфир. Выпавший в осадок целевой продукт,загрязненный примесями исходных соединений, промывают водой и сушат в вакууме до постоянного веса. Водные промывки помогают отделить и -бензоиларгинин и пнитроанилин, целевое соединение - - получают хроматографически чистым, с константами, соответствующими литературным 2, 3. Пример 1. Получение -бензоиларгинина гидрохлорида. 8186 1 2006.06.30 К 3,48 г (20 ммоль) -аргинина прибавляют 6 мл воды и к перемешиваемой суспензии небольшими порциями приливают раствор 3,48 мл (30 ммоль) хлористого бензоила в 10 мл диоксана. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 часа, затем упаривают в вакууме при температуре не выше 45 С до полной отгонки растворителей. Остаток - прозрачное густое масло - промывают декантацией смесью ацетон-эфир 11, эфиром и растворяют в 8 мл метанола. К метанольному раствору прибавляют 10 мл ацетона, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и 10 мл ацетона, спустя 5 минут 30 мл эфира и оставляют на 3 часа при 0-3 С. Выпавший осадок отделяют фильтрованием,промывают на фильтре эфиром и сушат в вакууме над Р 2 О 5 до постоянного веса. Получают 5,79 г (92 ) -бензоиларгинина гидрохлорида в виде белого кристаллического порошка. Т.пл. 263-265 С.0,37 (н-бутанол-уксусная кислота-водаэтилацетат 4111), 0,41 (ацетон-метанол-уксусная кислота 421). (Б). Лит.3 Т.пл. 265 С. Пример 2. Получение -бензоиларгинил-п-нитроанилида гидрохлорида. 4, 72 г (15 ммоль) -бензоиларгинина гидрохлорида растворяют при перемешивании в 15 мл диметилформамида и добавлением каплями 0,31 мл пиридина устанавливают рН 7-8, контролируя кислотность раствора лакмусовой бумажкой. К полученному раствору прибавляют 2,11 г (15,3 ммоль) п-нитроанилина и после его растворения при интенсивном перемешивании небольшими порциями присыпают 3,24 г (15,7 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, при этом наблюдают разогрев реакционной смеси и образование осадка дициклогексилмочевины. Реакционную смесь перемешивают в течение 15 часов,затем отделяют фильтрованием осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату прибавляют 40 мл эфира. Выпавшее желтое масло кристаллизуется при стоянии в течение двух часов. Кристаллический осадок отделяют фильтрованием, промывают эфиром и сушат в вакууме в течение 1 часа. Подсушенный осадок суспендируют в 10 мл воды, переносят на фильтр,промывают водой (34 мл) и высушивают в вакууме над Р 2 О 5 до постоянного веса. Получают 4,96 г (76 ) -бензоиларгинина-п-нитроанилида гидрохлорида в видебелого кристаллического порошка с желтоватым оттенком. Т.пл. 263-267 С.0,61(н-бутанол-уксусная кислота-вода-этилацетат 4111), 0,72 (ацетон-метанол-уксусная кислота 421). На ИК-спектре присутствует карбонильная полоса (амид ) - 1630 см-1 и полоса гуанидиновой группы - 1660 см-1. Элементный состав соответствует формуле 192364. Найдено С 52,50 , Н 5,37 ,19,27 , С 8,30 . Вычислено С 52,47 ,Н 5,33 ,19,31 , С 8,16 . Лит. Т.пл. 262-263 С 2 Т.пл. 262 С 1. Источники информации 1..,.,.. . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3