Способ определения функционального ответа лейкоцитов на процессы коагуляции и фибринолиза

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ОТВЕТА ЛЕЙКОЦИТОВ НА ПРОЦЕССЫ КОАГУЛЯЦИИ И ФИБРИНОЛИЗА(71) Заявитель Научно-исследовательский институт радиационной медицины Минздрава Республики Беларусь(73) Патентообладатель Научно-исследовательский институт радиационной медицины Минздрава Республики Беларусь(57) Способ определения функционального ответа лейкоцитов на процессы коагуляции и фибринолиза путем постановки реакции морфологической диссоциации крови, отличающийся тем, что проводят микрофлюориметрическое исследование лейкоцитов из третьей фракции реакции морфологической диссоциации крови и при уменьшении интенсивности красного свечения по отношению к контрольному исследованию диагностируют первый полноценный тип функционального ответа, а при отсутствии изменений или увеличении интенсивности красного свечения - второй неполноценный, тип функционального ответа лейкоцитов.(56) 1. Иванов Е.П. Морфологическая диссоциация при свертывании втореф. дис. канд. мед. наук. - Л.,1965. Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике в кардиологии, коагулологии, реаниматологии и может быть использовано для раннего определения типа функционального ответа лейкоцитов (в частности полиморфноядерных нейтрофилов) на процессы коагуляции и фибринолиза. Известен способ постановки реакции морфологической диссоциации крови 1. Однако этот способ не может быть использован для определения функционального состояния лейкоцитов, в частности полиморфноядерных нейтрофилов (ПМЯЛ), в ответ на процессы коагуляции и фибринолиза. Задачей изобретения является определение типа функционального ответа ПМЯЛ в ответ на процессы коагуляции и фибринолиза. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения функционального ответа лейкоцитов на процессы коагуляции и фибринолиза путем постановки реакции морфологической диссоциации крови, проводят микрофлюориметрическое исследование лейкоцитов из третьей фракции реакции морфологической диссоциации крови и при уменьшении интенсивности красного свечения по отношению к контрольному исследованию диагностируют первый полноценный, тип функционального ответа, а при отсутствии изменений или увеличении интенсивности красного свечения - второй неполноценный тип функционального ответа лейкоцитов. Предложенный способ осуществляется следующим образом. Получают пробу венозной крови с соблюдением правил забора и температурных режимов. Соотношение кровь антикоагулянт 1 - 2 гепарина на 1,0 мл крови. Приготавливают препараты крови на предметном стекле смешивают каплю крови с раствором акридинового оранжевого (концентрация 1 х 10 - 5 М) в соотношении 11 (например 0,1 мл крови и 0,1 мл красителя). Указанную смесь крови и акридинового оранжевого накрывают покровным стеклом, а избыток смеси удаляют с помощью фильтровальной бумаги. Исследуют интенсивность флуоресценции ПМЯЛ в приготовленных препаратах крови с помощью двухканального микрофлюориметра - фотометра (ДМФ - 2). Измеряют интенсивность красной флуоресценции на длине волны в 640 нм., которая выражается в относительных оптических единицах (отн. опт. ед.). Это значение интенсивности флуоресценции является контрольным, по отношению к которому в дальнейшем определяют функциональный ответ ПМЯЛ. 2637 1 Параллельно у пациента забирают 2,0 мл венозной крови в сухую центрифужную пробирку с делениями для постановки реакции морфологической диссоциации крови. Пробирку с делениями закрывают резиновой пробкой 16, обрезанной на половину. В пробку предварительно вставлен металлический якорь и эксцентрично игла для внутримышечных инъекций. Пробирка с кровью переворачивается так, чтобы кровь натекала на якорь и образовала пирамиду, основание которой упирается в пробирку, и вершина находится на конце якоря. Отмечается момент, когда кровь свернется. Для этого пробирка постоянно наклоняется в руке (каждые 20 - 30 секунд) и проверяется натекает ли кровь на якорь. После свертывания крови в пробирке ее (пробирку) помещают под углом в 45 в термостат при 37 С на 2,0 часа. За время нахождения пробирки в термостате происходит реакция морфологической диссоциации крови. Кровь разделяется на три фракции 1-я - собственно сгусток крови, 2-я - объем сыворотки и 3-я - объем форменных элементов крови. После окончания времени термостатирования пробирка ставится в штатив пробкой вверх. Пробка осторожно вращается так,чтобы отделить от стенки пробирки закрепившийся на якоре сгусток. Затем пробирку снова ставят в штатив на 10 - 15 минут и после этого пробирку с укрепившимся на ней сгустком удаляют, а пробирку с жидкой кровью центрифугируют в течение 15 - 20 минут при 1500 - 2000 об/мин. После центрифугирования кровь разделяется на сыворотку и форменные элементы крови, которые соответствуют 2-й и 3-й фракциям реакции морфологической диссоциации крови. Затем из 3-й фракции крови отбирают лейкоциты, которые помещают на предметное стекло и в дальнейшем используют для приготовления препаратов (как описано выше) после окрашивания акридиновым оранжевым и проводят цитофлюориметрическое исследование ИКС (опытное измерение). После получения значения ИКС лейкоцитов из третьей фракции реакции морфологической диссоциации крови проводят сравнение полученных результатов двух измерений (контрольного и опытного) и рассчитывают процент изменения ИКС (при этом контрольное значение ИКС принимается равным 100 ). При уменьшении значения ИКС, по сравнению с контролем, устанавливают 1-й (полноценный) тип функционального ответа, а при отсутствии изменений или увеличении ИКС - 2-й (неполноценный) тип функционального ответа ПМЯЛ крови. Для достижения поставленной задачи заявляемого способа нами обследовано 32 пациента с ИБС. Приводим примеры использования способа Пример 1. Больной К., 55 лет, история болезни (и.б.)1500/415. Поступил в клинику с диагнозом ИБС,кардиосклероз аорты, . Облитерирующий атеросклероз сосудов нижних конечностей. 24.03.93 г. проведено исследование функционального ответа ПМЯЛ для этого проводят забор венозной крови в соотношении кровь/антикоагулянт, как 1 - 2 гепарина на 1,0 мл крови. Затем готовят препарат для цитофлюориметрического анализа, смешивая кровь с красителем (акридиновый оранжевый в соотношении 11. Измеряют ИКС - контроль. Параллельно забирают 2,0 мл венозной крови в сухую центрифужную пробирку с делениями и ставят реакцию морфологической диссоциации крови. Из третьей фракции отбирают лейкоциты и готовят из них препарат крови, окрашивают его и измеряют ИКС лейкоцитов. Исходное значение (контроль) ИКС составила у данного пациента 1,77 отн. опт. ед. Значение ИКС после реакции морфологической диссоциации крови была 0,61 отн. опт. ед. (увеличение на 10,91 по сравнению с контролем). Заключение 2-й (неполноценный) тип функционального ответа лейкоцитов (на основании увеличения значения ИКС). Больному проведен курс лечения. Повторное исследование показало исходное (контроль) состояния ПМЯЛ по ИКС 0,44 отн. опт. ед. После реакции морфологической диссоциации крови ИКС составила 0,24 отн. опт. ед. (45,45 снижения по сравнению с контролем). Обычно реакция морфологической диссоциации крови применяется для постановки теста спонтанного фибринолиза (СФ). Лейкоциты из 3-й фракции берутся для исследования как раз после определения СФ. Заключение 1-й (полноценный) тип функционального ответа ПМЯЛ. Учитывая снижение показателя ИКС в повторном анализе, так и по сравнению с первым анализам (20 снижения по сравнению между ИКС в контроле при первом и втором анализах и 65,57 снижения значений ИКС после теста СФ в первом и втором анализах). Таким образом, в результате проведенного лечения улучшился функциональный ответ лейкоцитов. Пример 2. Больной М., 53 лет, и.б.909/277. Поступил в клинику с диагнозом ИБС, постинфарктный(1986 г.) кардиосклероз, атеросклероз аорты, симптоматическая гипертензия, Н - 2 а. Хронический обструктивный бронхит в стадии обострения. Базальный пневмосклероз. Эмфизема легких. ДН - 2. Фурункулез. 24.03.93 г. проведен цитофлюориметрический анализ функционального ответа лейкоцитов для этого забирают пробу венозной крови (соотношение кровь/антикоагулянт, как 1 - 2 гепарина на 1,0 мл крови),взятую кровь смешивают с красителем в соотношении 11 и измеряют ИКС. Параллельно ставят тест СФ,отбирают после его постановки лейкоциты из третьей фракции, готовят препарат крови, окрашивают его и измеряют ИКС. Значение ИКС составило в венозной крови 0,66 отн. опт. ед. (контрольное значение) ИКС после теста СФ- 0,44 отн. опт. ед. (33,33 снижения по сравнению с контролем). 2 2637 1 Заключение 1-й (полноценный) тип функционального ответа ПМЯЛ на процессы коагуляции и фибринолиза на основании снижения ИКС по сравнению с контрольным значением показателя. Больному проведен курс лечения (сердечные гликозиды, салуретики, эуфиллин, антибактериальная терапия). Повторный анализ функционального ответа лейкоцитов после окончания курса лечения контрольное значение ИКС составило 0,67 отн. опт. ед. После постановки теста СФ значение ИКС - 0,23 отн. опт. ед.(65,67 снижения по сравнению с контролем). Заключение 1-й (полноценный) тип функционального ответа лейкоцитов, учитывая однотипность изменений изучаемого показателя до и после проведенного лечения. Пример 3. Больной С., 57 лет, и.б.3789/1212. Поступил в клинику с диагнозом ИБС, стенокардия напряжения ФК- , постинфарктный кардиосклероз, атеросклероз аорты, симптоматическая гипертензия,Н - 1. 19.01.93 г. проведен анализ функционального ответа лейкоцитов для этого берут пробу венозной крови,готовят смесь крови с красителем - акридиновый оранжевый и проводят исследование ИКС (контроль). Параллельно ставят реакцию морфологической диссоциации крови в тесте СФ. Исходное значение ИКС (контроль) составило 1,96 отн. опт. ед. После постановки теста СФ - 1,98 отн. опт. ед. (отсутствие изменений по сравнению с контролем). Заключение 2-й (неполноценный) тип функционального ответа полиморфноядерных лейкоцитов на процессы коагуляции и фибринолиза. Пример 4. Пациент С., 61 года, и.б.536/157. Поступил в клинику с диагнозом ИБС, стенокардия напряжения ФК - 2, полная блокада левой ножки пучка Гиса, атеросклероз аорты, Н - 2 а. 11.03.93 г. проведено исследование функционального ответа лейкоцитов для этого берут пробу венозной крови, стабилизированную гепарином из расчета 1 - 2 на 1,0 мл крови, готовят препарат крови в смеси с красителем в соотношении 11, измеряют с помощью прибора ДМФ - 2 интенсивность красного свечения(контрольное значение). Параллельно проводят постановку теста СФ, из 3-й фракции реакции морфологической диссоциации крови отбирают ПМЯЛ, готовят препарат, окрашивают его и измеряют ИКС. Контрольное значение ИКС составило 0,18 отн. опт. ед. После постановки теста СФ значение ИКС - 0,27(50 увеличения по сравнению с контролем). Заключение 2-й (неполноценный) тип функционального ответа. Проведено консервативное лечение (антиагреганты, антиангинальные препараты). Проведен повторный анализ функционального ответа ПМЯЛ контрольное значение ИКС составило 0.56 отн. опт. ед. ИКС после постановки теста СФ - 1,51 отн. опт. ед. (169,64 увеличения по сравнению с контролем). Заключение в обоих случаях 2-й (неполноценный) тип функционального ответа ПМЯЛ на процессы коагуляции и фибринолиза. Пример 5. Больная М 60 лет, и.б.905/275. Поступила в клинику с диагнозом Дисциркуляторная энцефалопатия -й степени с бульбарным синдромом. ИБС кардиосклероз, атеросклероз аорты, симптоматическая гипертензия,- 2. Мочекаменная болезнь. 23.03.93 г. проведено исследование функционального ответа ПМЯЛ. Для этого получают пробу венозной крови, стабилизированную гепарином (1 - 2 на 1,0 мл крови), смешивают кровь с красителем (в соотношении 11) и измеряют показатель ИКС. Параллельно осуществляют постановку реакции морфологической диссоциации крови в тесте СФ. После постановки теста СФ, отбирают лейкоциты из 3-й фракции, готовят препарат крови, окрашивают его и измеряют с помощью прибора ДМФ - 2 ИКС. Контрольное значение ИКС составило 1,25 отн. опт. ед. Значение. ИКС после постановки теста СФ - 0,93 отн. опт. ед. (25,6 снижения по сравнению с контролем). Заключение 1-й (полноценный) тип функционального ответа ПМЯЛ на процессы коагуляции и фибринолиза. Таким образом, по сравнению с известными решениями, заявляемый способ обладает следующими преимуществами 1. Возможность динамической оценки функционального ответа ПМЯЛ на процессы коагуляции и фибринолиза. 2. Возможность оценки эффективности проводимого лечения с помощью использования заявляемого способа. 3. Простота выполнения заявляемого способа. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3