Способ получения иммуномагниточувствительных альбумин-протеиновых микрокапсул, коньюгированных с антителами

01 33/531 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ АЛЬБУМИН-ПРОТЕИНОВЫХ МИКРОСФЕР, КОНЪЮГИРОВАННЫХ С АНТИТЕЛАМИ(71) Заявитель Витебский медицинский институт(73) Патентообладатель Витебский медицинский институт(57) 1. Способ получения иммуномагниточувствительных альбумин-протеиновых микросфер, конъюгированных с антителами путем термической коагуляции растворов альбумина человека лиофилизированного и протеина.с магнетитом, очистки взвеси микрокапсул диэтиловым эфиром, перевода взвеси из диэтилового эфира в водную фазу и последующего конъюгирования микрокапсул с антителами, отличающийся тем, что при переводе взвеси микрокапсул из диэтилового эфира в водную фазу используют 0,1 ный раствор твина-80. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед конъюгированием микрокапсул с антителами проводят предварительную обработку взвеси микрокапсул 0,3 -ным раствором хлорида хрома . Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к технологии получения магниточувствительных микрокапсулированных носителей, коньюгированных с антителами, для выделения биологически активных материалов посредством сепарации в магнитном поле. Существует способ получения микрокапсул из альбумина человека лиофилизированного и протеина., содержащий магнетит 1, посредством термической коагуляции. Однако, недостатком этого способа является то, что полученные с его помощью микрокапсулы обладают низкой иммунной специфичностью по отношению к выделяемым клеткам вследствие большой степени диффузии молекул антител с их поверхности. Этот недостаток обуславливает низкую эффективность использования микрокапсул в процессе осуществления деплеции клеток-мишеней. Вторым недостатком описанного способа изготовления иммуномагнитных микрокапсул является сложность перевода взвеси микрокапсул в водную среду в процессе их отмывки от масляной фазы. Третьим недостатком вышеуказанного метода является использование значительных количеств протеина.для изготовления иммуномагнитных микрокапсул. Задачей изобретения является усовершенствование метода изготовления микрокапсул из протеина А и альбумина человека размерами 2-5 мкм с высокой степенью активности при коньюгации с антителами. Сущность предлагаемого изобретения заключается в использовании растворов поверхностно активных веществ, в частности 0,1 раствора твина-80, в процессе перевода взвеси микрокапсул из диэтилового эфира в водную среду во время их отмывки от масляной фазы и в предварительной обработке взвеси микрокапсул свежеприготовленным раствором хлорида хромаперед последующим добавлением антител, в результате чего образуются дополнительные хелатные связи антител с поверхностью микрокапсул. Создание дополнительных хелатных связей между поверхностью микрокапсул и лигандами антител позволяет эффективно использовать протеин А, который является достаточно дорогостоящим компонентом микрокапсул, в количествах в 5 раз меньших, чем предложены авторами вышеуказанной работы 1. 2196 1 Синтез альбумин-протеиновых микрокапсул производят следующим образом в стеклянную емкость отвешивают альбумин человека лиофилизированный и добавляют белокв соотношении 15. Магнитный компонент, в качестве которого используется мелкодисперсный магнетит 34, полученный щелочным соосаждением солей железа 2-х валентного (4) и 3-х валентного (3), вводят в белковую смесь в количестве 20 от сухой массы компонентов. Затем для набухания смеси белков добавляют дистилированную Н 2 О в соотношении 31 к общей массе компонентов и перемешивают до равномерного распределения ингредиентов в жидкости. К полученной смеси добавляют охлажденное оливковое масло в соотношении 101 по объему и диспергируют ультразвуком мощностью 40 Вт дробно по 30 секунд в течение 5 минут на приборе УЗДН-А с использованием ледяной бани. Полученную эмульсию типа вода в масле струйным методом вводят при тщательном перемешивании в нагретое до 120 С оливковое масло, объем которого 10-тикратно превышает объем эмульсии. Перемешивание продолжают в течение 20 минут. Суспензию микрокапсул в масле охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют при 300. Затем надосадок сливают, а полученный осадок микрокапсул отмывают 5 раз безводным диэтиловым эфиром, взятым в количестве 10-кратно меньшем, чем удаленная масляная фаза, с последующим осаждением микрокапсул на магните с напряженностью магнитного поля 0,3 Тл в течение 15 минут. На стадии перевода взвеси микрокапсул из диэтилового эфира в водную среду микрокапсулы, осевшие под действием магнитного поля, диспергируют в 0,1 водном растворе твина-80, взятом том же объеме, что и диэтиловый эфир. Затем микрокапсулы осаждают на магните с напряженностью магнитного поля 0,3 Тл и 5-кратно отмывают дистилированной водой, взятой в том же объеме, что и 0,1 раствор твина-80 с последующим осаждением на магните. Затем осевшие микрокапсулы ресуспендируют при помощи ультразвука мощностью 40 Вт в 0,3 растворе хлорида хрома , вятом в том же объеме, что и водная фаза,для активации их поверхности, и инкубируют 30 минут при температуре 20 С, после чего суспензию осаждают на магните в течение 10 минут. Инкубацию с антителами проводят в 0,2 М фосфатном буфере рН 7,4 при температуре 4 С в течение 12 часов (соотношение микрокапсул с антителами составляет 1001 по массе). От избытка неприсоединившихся антител и следовых количеств хлорида хромаосвобождаются осаждением суспензии микрокапсул на магните в течение 10 минут с последующий 3-хкратной отмывкой 0,2 М фосфатным буферным раствором рН 7,4. Для сравнения эффективности активации поверхности микрокапсул при помощи хлоридас другими методами в качестве альтернативных методов выбраны 1) Инкубация микрокапсул с антителами в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 вследствие сохранения свойств протеина А специфически связывать антитела 2) Дополнительная активация белковой поверхности микрокапсул 2,5 раствором глутарового альдегида в течение 30 минут. Количественную оценку проведенной коньюгации производят постановкой иммуноферментной реакции с использованием антител, меченных пероксидазой хрена, следующим образом исследуемые типы микрокапсул доводят до стандартной концентрации, при которой оптическая плотность взвеси микрокапсул при длине волны 750 нм равна 10,05. В лунки 96-луночной плоскодонной планшеты для иммуноферментного анализа помещают микрокапсулы каждой из вышеуказанных модификаций по 100 мкл в каждую лунку и добавляют раститрованные диагностические антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена. После проведения инкубации в течение 3 часов при температуре 20 С планшеты с микрокапсулами помещают на постоянный магнит с напряженностью магнитного поля 0,3 Тл на 10 мин. для осаждения микрокапсул и 3 раза отмывают от несвязавшихся антител 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,4 с последующим осаждением микрокапсул на магните. После отмывки в каждую лунку с осадком микрокапсул добавляют 150 мкл 0,1 м фосфатного буферного раствора 7,4, добавляют 50 мкл 0,04 раствора ортофенилендиаминав 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН 5,4. После инкубации в темноте в течение 10 минут, для остановки реакции добавляют в каждую лунку по 50 мкл 0,5 М раствора серной кислоты, Ту же реакцию проводят с раститрованными антителами в лунках той же планшеты для построения калибровочной кривой. Планшеты центрифугируют и переносят окрашенный надосадок в соседнюю лунку планшеты для замера оптической плотности. Оптическую плотность окрашенного субстрата измеряют на аппарате АИФ-Ц-01 С. В результате количественной оценки установлено, что связывающая способность микрокапсул, обработанных 0,3 раствором хлорида хрома , составляет 96,6. Она не зависит от количества микрокапсул, но проявляет достоверную зависимость от количества используемых моноклональных антител (таблица). 2196 1 Связывающая способнсть микрокапсул, обработанных 3 достоверно выше, чем обработанных глутаровым альдегидом или в 0,1 М фосфатном буфере, где микрокапсулы присоединяют моноклональные антитела за счет активных центров протеина А. Результаты проведения иммуноферментного анализа по определению связывающей способности микрокапсул (МКК) и монгоклональных антител (МКА) при различных способах активации. МКК МКК МКК МКК МКК МКК МКК Тип МКА МКА МКА МКА МКА МКА МКА активации 11 12 14 18 116 132 164 Глутаровый альдегид 1 1,89 1,85 1,98 1,78 1,73 1,73 1,66 2 2,02 1,98 1,93 1,83 1,79 1,80 1,74 3 1,86 1,84 1,89 1,79 1,74 1,81 1,72 4 1,80 1,76 1,82 1,76 1,66 1,69 1,68 5 1,92 2,09 2,02 1,86 1,82 1,86 1,74 6 1,84 1,80 1,83 1,73 1,63 1,60 1,63 7 1,80 1,70 1,78 1,71 1,55 1,65 1,65 1,900,07 1,880,089 1,890,09 1,710,10 1,670,14 1,710,10 1,630,09 Синтезированные альбумин-протеиновые микрокапсулы имеют ряд преимуществ перед прототипом,описанным в работе 1 1) приготовление и очистка их достаточно просты и быстры, 2) антитела могут быть связаны лигандами как с протеином А, так и с дополнительными активными центрами, образовавшимися после активации поверхности микрокапсул металлохелатным комплексообразующим агентом, что позволяет получить высокий процент связывания и значительно уменьшить диффузию антител с поверхности микрокапсул, полученные микрокапсулы легко ресуспендируются в водных растворах, проявляют минимальное неспецифическое связывание и обладают высокой иммунной специфичностью к клеткам-мишеням. Микрокапсулы являются стабильными в диапазоне рН от 2 до 9. Микрокапсулы обладают серологической специфичностью антител совместно с сильным селективным ответом на магнитное поле и могут быть эффективно использованы при выделении необходимых клеток из клеточных смесей в магнитном поле. оставитель А.И. Сорокин Редактор В.Н. Позняк Корректор Т.Н. Никитина Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.