Способ выделения митохондрий мышечного слоя тонкой кишки

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ МЫШЕЧНОГО СЛОЯ ТОНКОЙ КИШКИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Автор Косинец Владимир Александрович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56) ВИНОГРАДОВ А.Д. и др. Биохимия митохондрий. Биоэнергетика Руководство к практическим занятиям по биохимии животных. - М. Издательство Московского университета, 1977. . 5-11.1386907 1, 1988.1745258 1, 1992.(57) Способ выделения митохондрий мышечного слоя тонкой кишки, включающий получение гомогената ткани мышечного слоя и выделение митохондрий дифференциальным центрифугированием, отличающийся тем, что в качестве среды гомогенизации ткани и выделения митохондрий используют среду, содержащую маннитол в концентрации 120 мМ, сахарозу в концентрации 70 мМ, трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорид в концентрации 50 мМ, этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации 5 мМ и бычий сывороточный альбумин в концентрации 2 . Изобретение относится к области медицины, в частности к биоэнергетике, и может быть использовано для изучения функциональной активности митохондрий мышечного слоя тонкой кишки. Важным условием выделения интактных митохондрий мышечного слоя тонкой кишки является тщательное удаление слизистого слоя, содержащего большое количество жирных кислот - мощных разобщителей процесса окислительного фосфорилирования. Однако в подавляющем большинстве случаев выполнить данную процедуру в полном объеме не представляется возможным. В литературе описан способ выделения митохондрий мышечного слоя тонкой кишки с использованием среды следующего состава 250 мМ сахароза, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ с добавлением 50 ед/мл гепарина,7,4 1. Наличие в среде гепарина способствует переводу гомогената ткани в гелеобразное состояние, что крайне затрудняет получение митохондриальной фракции. В предложенном нами способе негативное влияние жирных кислот устраняется путем добавления в среду 2 -ного лиофилизированного сывороточного альбумина быка. Комбинация 120 мМ маннитола и 70 мМ сахарозы способствует созданию оптимальной осмолярности среды выделения митохондрий. 13689 1 2010.10.30 Способ осуществлялся следующим образом. Под нембуталовым наркозом (30 мг/кг) из брюшной полости животных извлекали тонкую кишку, которую немедленно промывали и очищали от содержимого ледяным физиологическим раствором, затем помещали в охлажденную до 0 С среду выделения(120 мМ маннитол, 70 мМ сахароза, 50 мМ Трис-, 5 мМ ЭДТА, 2 лиофилизированный бычий сывороточный альбумин,7,4). Все последующие манипуляции выполнялись при температуре 0-2 Сиспользованием предварительно охлажденных посуды и инструментов. Участок тонкой кишки продольно вскрывали, острым краем предметного стекла удаляли слизистый и серозный слои, после чего материал промывали средой выделения. Измельченную ткань гомогенизировали при добавлении 1 мл среды выделения на 1 г ткани в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с тефлоновым пестиком с 4-5 вертикальными ходами пестика. Гомогенат центрифугировали при 600 и 410 мин с целью осаждения ядер и клеточных обломков. Полученный супернатант центрифугировали при 12000 и 4 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 30 мл среды выделения и суспензию центрифугировали при 12000 и 4 в течение 10 мин. Супернатант удаляли, осадок суспендировали в среде выделения до концентрации 30-40 мг белка на мл. О качестве выделенных митохондрий судили по оценке их функциональной активности. Измерение поглощения кислорода митохондриями проводили полярографическим методом в герметичной термостатируемой ячейке объемом 2 мл с постоянным перемешиванием магнитной мешалкой при 25 . Уровень кислорода измерялся электродом Кларка,подключенным к программно-аппаратному комплексу -4. Среда инкубации содержала 125 мМ , 2 мМ Трис-, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ 24,7,4. В ячейку вносили суспензию митохондрий в расчете 3-5 мг белка на 1 мл. В качестве субстрата окисления использовали янтарную кислоту (сукцинат) в количестве 4 мМ на пробу. Для ингибированиякомплекса дыхательной цепи митохондрий использовали ротенон в количестве 5 мМ на пробу. По данным полярограммы рассчитывали скорость дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях (2 - скорость окисления субстрата, 3 - скорость фосфорилирующего окисления, 4 - скорость окисления после фосфорилирования), скорость разобщенного дыхания (ДНФ). Рассчитывали следующие показатели, характеризующие сопряжение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях дыхательный контроль по Ларди-Уэллману (ДКЛУ 3/2), дыхательный контроль по Чансу-Уильямсу(ДНФДНФ/4), скорость фосфорилирования добавки АДФ (АДФ/). Скорость потребления рассчитывали в нг-атом 2/мин/мг (Виноградов А.Д. и др., 1977). Коэффициент АДФ/ выражали в нмолях АДФ за 1 мин на 1 мг белка. Белок определяли биуретовым методом. Результаты представлены в таблице. Функциональная активность интактных митохондрий мышечного слоя тонкой кишки Группа Таким образом, предложенный способ позволяет выделять митохондрий мышечного слоя тонкой кишки с высокой степенью интактности. 2 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3