Способ оценки способности связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАНИЯ КАТИОНОВ КАДМИЯ ИЛИ СВИНЦА В КЛЕТКАХ ЛИСТЬЕВ РАСТЕНИЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Радюк Мечислав Степанович Будакова Елена Анатольевна Шалыго Николай Владимирович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ оценки способности связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения, заключающийся в том, что листья инкубируют в растворе хлорида кадмия или свинца, гомогенизируют в дистиллированной воде, отделяют центрифугированием супернатант, регистрируют поглощение света супернатантом при длине волны 268 нм и поглощение света присутствующими в супернатанте фитохелатиновыми комплексами катионов кадмия или свинца соответственно при длине волны 308 или 315 нм, вычисляют отношение поглощения света при 308 или 315 нм к поглощению при 268 нм, по которому оценивают способность связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения, причем чем выше это отношение, тем выше указанная способность. Изобретение относится к физиологии растений и экологии, в частности к способам оценки способности связывания катионов тяжелых металлов клетками листьев растения, и может быть использовано для выведения и создания устойчивых к тяжелым металлам сортов сельскохозяйственных культур. Известен способ оценки способности клеток растений к связыванию катионов тяжелых металлов по содержанию в них фитохелатинов (ФХ) 1. Однако выяснилось, что уровень ФХ в растениях, синтез которых индуцируется катионами тяжелых металлов, сам по себе не определяет способность клеток растений к их связыванию, поскольку некоторые устойчивые к катионам тяжелых металлов, в частности, линии растений содержали меньшее количество ФХ, чем неустойчивые 2. Известен способ оценки способности связывания катионов кадмия по образованию их нерастворимых высокомолекулярных комплексов с ФХ и содержащих в своем составе неорганический сульфид 3, включающий в себя гомогенизацию, экстракцию и хроматографию полученного материала с помощью гель-фильтрации. Элюат растворяли в азотной кислоте и содержаниеопределяли с помощью атомного абсорбционного спектрофотометра. Материал, содержащий комплексыс ФХ обессоливали с помощью гель 12516 1 2009.10.30 фильтрации и разгоняли с помощью хроматографа высокого давления на обратнофазной колонке. К полученному препарату добавляли , который образует производные с нерастворимыми сульфидными фитохелатиновыми комплексами , поглощающими в области 412 нм. Более устойчивые кклетки растений содержали большее количество нерастворимых сульфидных высокомолекулярных комплексов. Недостатками известного способа является длительность подготовки исследуемого препарата, необходимость наличия дорогостоящего оборудования хроматографа высокого давления и атомного абсорбционного спектрофотометра для определения содержания таких комплексов. Задачей изобретения является разработка простого и быстрого в исполнении экономичного способа оценки способности связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения. Результат достигается тем, что способ оценки способности связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения заключается в том, что листья инкубируют в растворе хлорида кадмия или свинца, гомогенизируют в дистиллированной воде, отделяют центрифугированием супернатант, регистрируют поглощение света супернатантом при длине волны 268 нм и поглощение света присутствующими в супернатанте фитохелатиновыми комплексами катионов кадмия или свинца, соответственно, при длине волны 308 или 315 нм,вычисляют отношение поглощения света при 308 или 315 нм к поглощению при 268 нм,по которому оценивают способность связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения, причем чем выше это отношение, тем выше указанная способность. Сущность изобретения заключается в использовании свойства комплексов катионов кадмия или свинца и их сульфидов с фитохелатинами растений поглощать в области 308 нм или 315 нм соответственно. В конечном итоге, катионы кадмия или свинца оказываются в составе устойчивых нерастворимых высокомолекулярных фитохелатиновых комплексов, содержащих в своем составе неорганический сульфид и депонирующихся в вакуолях клеток. Способ осуществляют следующим образом. Срезанные листья растения в течение 24 ч инкубируют на растворах хлоридов кадмия(до 2 мМ) или свинца (до 10 мМ). Затем листья промывают водой и удаляют их нижние части, находившиеся в растворе солей. Оставшуюся часть листьев растирают в 4 мл дистиллированной воды, после чего гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 6000. 0,1 мл полученного супернатанта разбавляют до 2 мл дистиллированной водой и регистрируют спектр поглощения в интервале от 250 до 400 нм. О содержании комплексов судят по отношению поглощения света при 308 нм для кадмия или 315 нм для свинца к максимуму поглощения белков при 268 нм. Примеры конкретного выполнения. Пример 1 7-дневные листья ячменя сорта Гонар инкубируют на 0,5 миллимольном растворе 2 в течение 1 суток. При таких условиях отношение 308/268 увеличивалось по сравнению с контрольными растениями в 1,38 раза. Пример 2 7-дневные листья ячменя сорта Гонар инкубируют на 1,0 миллимольном растворе 2 в течение 1 суток. При таких условиях отношение 308/268 увеличивалось по сравнению с контрольными растениями в 1,45 раза. Пример 3 7-дневные листья ячменя сорта Гонар инкубируют на 2,0 миллимольном растворе 2 в течение 1 суток. При таких условиях отношение 308/268 увеличивалось по сравнению с контрольными растениями в 1,53 раза. Аналогичным образом отношение 315/268 увеличивалось по мере увеличения концентрации катионов свинца. 2 12516 1 2009.10.30 Таким образом, заявляемый способ оценки способности связывания катионов кадмия или свинца в клетках листьев растения, основанный на спектрофотометрическом определении содержания комплексов катионов тяжелых металлов и их сульфидов с фитохелатинами, является более простым и дешевым по сравнению с известными способами. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3