Способ оценки устойчивости сорта люпина узколистного к ионам свинца

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТА ЛЮПИНА УЗКОЛИСТНОГО К ИОНАМ СВИНЦА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Домаш Валентина Иосифовна Шарпио Тамара Петровна Забрейко Светлана Алексеевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(56)2007071 С 1, 1994. Головатый С.Е. и др. Природные ресурсы. - 2002. -3. - С. 120-125. Моисеенко А.А. и др. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. -1. - С. 51-54.(57) Способ оценки устойчивости сорта люпина узколистного к ионам свинца, отличающийся тем, что семена исследуемого сорта люпина проращивают в течение 3 суток в водной среде, содержащей (3)2 в концентрации 0,3 мМ в опыте, и в водной среде, не содержащей (3)2 в контроле, проростки из опыта и контроля измельчают, отбирают соответствующие пробы по 0,5 г, растирают их с 20 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 7,0,оставляют на 1-1,5 ч при температуре от 3 до 4 для экстракции протеолитических ферментов, получают надосадочную жидкость, инкубируют ее с казеином, измеряют поглощение экстрактов при 280 нм и определяют протеолитическую активность (ПА) по формуле,ПАо к 30 н где Ео - значение поглощения экстракта в опыте Ек - значение поглощения экстракта в контроле- объем надосадочной жидкости, взятой для инкубации с казеином, мл н - масса пробы проростков в граммах в пересчете на абсолютно сухую массу,при этом сорт люпина считают устойчивым к ионам свинца, если в расчете на 1 г абсолютно сухой массы ПА равна 13-15 единицам, среднеустойчивым, если ПА равна 25-27 единицам, и неустойчивым, если ПА равна 34-35 единицам. Изобретение относится к физиологии и селекции растений и может быть использовано при определении реакции сорта люпина узколистного к действию факторов внешней среды, в частности к ионам свинца. Известен способ определения устойчивости растений к тяжелым металлам, предусматривающий выращивание растений в песчаной культуре на питательной смеси Кнопа с 10874 1 2008.08.30 добавлением тяжелых металлов, и определение устойчивости через отношение биомассы на контроле и в опыте 1. Недостатками способа являются трудоемкость процесса, отсутствие ранней диагностики и дифференциации растений по устойчивости, длительность селекционного отбора. Известен способ определения устойчивости растений к тяжелому металлу, включающий выращивание растений на питательной смеси Кнопа с добавлением уксуснокислой соли тяжелого металла и определение устойчивости через отношение массы растений в присутствии соли тяжелого металла к массе растений на контроле без соли тяжелого металла 2. Недостатками известного способа являются трудоемкость процесса, длительный методологический подбор концентраций для классификации устойчивости растений к соли тяжелого металла. Наиболее близким техническим решением является способ определения устойчивости растений к тяжелым металлам, включающий выращивание растений на питательной смеси Кнопа в присутствии уксуснокислой соли тяжелого металла и без нее и последующее определение устойчивости массы растений, выращенных в присутствии тяжелого металла и без него, причем в качестве соли тяжелого металла используют уксуснокислый никель в концентрации 3 мг/л, анализ массы растений проводят после 20-дневного выращивания и при отношении масс 1,0-0,9 сорта устойчивы к никелю, при отношении 0,8-0,5 среднеустойчивы, при отношении менее 0,5 неустойчивы 3. Однако этот способ обладает недостатком, заключающимся в отсутствии ранней диагностики, длительности и трудоемкости определения устойчивости растений к тяжелым металлам. Задачей является ранняя диагностика устойчивости люпина узколистного и ускорение селекционного отбора. Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки устойчивости сорта люпина узколистного к ионам свинца семена исследуемого сорта люпина проращивают в течение 3 суток в водной среде, содержащей (3)2 в концентрации 0,3 мМ в опыте, и в водной среде, не содержащей (3)2 в контроле, проростки из опыта и контроля измельчают, отбирают соответствующие пробы по 0,5 г, растирают их с 20 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 7,0, оставляют на 1-1,5 ч при температуре от 3 до 4 С для экстракции протеолитических ферментов, получают надосадочную жидкость, инкубируют ее с казеином, измеряют поглощение экстрактов при 280 нм и определяют протеолитическую активность ПА по формуле(к )360 ,ПА 30 н где Ео - значение поглощения экстракта в опыте Ек - значение поглощения экстракта в контроле- объем надосадочной жидкости, взятой для инкубации с казеином, мл н - масса пробы проростков в граммах в пересчете на абсолютно сухую массу,при этом сорт люпина считают устойчивым к ионам свинца, если в расчете на 1 г абсолютно сухой массы ПА равна 13-15 единицам, среднеустойчивым, если ПА равна 25-27 единицам, и неустойчивым, если ПА равна 34-35 единицам. Пример. Семена различных сортов люпина узколистного (.) проращивают в течение 3 суток в водной среде, содержащей 0,3 мМ (3)2 в опыте, и в водной среде, не содержащей (3)2 в контроле, проростки из опыта и контроля измельчают,отбирают соответствующие пробы по 0,5 г, растирают их с 20 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 7,0, оставляют на 1-1,5 часа при температуре от 3 до 4 С для экстракции протеолитических ферментов. Смесь центрифугируют 10-15 мин при 5-6 тыс. об/мин. В надосадочной жидкости определяют активность протеолитического фермента следующим образом. 2 10874 1 2008.08.30 В три опытные и контрольные пробирки (трехкратная повторность) вносят по 1 мл фосфатного буфера, рН 7,0, и 1 мл надосадочной жидкости. В контрольные пробирки вносят по 3 мл 5 -ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Пробирки ставят в водяную баню при 37 С и через 1-2 мин добавляют по 1 мл 1 -ного раствора казеина в 1/15 М фосфатном буфере, рН 7,0 (готовят путем растворения 1 г казеина в 100 мл 1/15 М фосфатного буфера, рН 7,0, и нагревания на водяной бане до полного растворения). Пробирки тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин, после чего в опытные образцы добавляют по 3 мл 5 -ной ТХУ для прекращения действия фермента. После этого содержимое пробирок(опытных и контрольных) фильтруют через плотный бумажный фильтр и измеряют поглощение экстрактов при 280 нм. Протеолитическую активность (ПА) определяют по формуле(к )360 ,ПА 30 н где Ео - значение поглощения экстракта в опыте Ек - значение поглощения экстракта в контроле- объем надосадочной жидкости, взятой для инкубации с казеином, мл н - масса пробы проростков в граммах в пересчете на абсолютно сухую массу. В таблице приведены данные определения.п/п Активность протеолитиче- Индекс толерантности ского фермента (ПА)/г абс. Сорт люпина считают устойчивым к ионам свинца, если в расчете на 1 г абсолютно сухой массы ПА равна 13-15 единицам, среднеустойчивым, если ПА равна 25-27 единицам, и неустойчивым, если ПА равна 34-35 единицам. Анализ данных таблицы показал, что ПА в семенах люпина коррелирует с индексом толерантности. Коэффициент корреляцииравен -0,92. Таким образом, при оценке устойчивости сорта люпина узколистного к ионам свинца активность протеолитического фермента можно определить в 30 образцах за 8-часовой рабочий день, а весь способ оценки занимает трое суток. Способ прост в исполнении, экономит растительный материал и значительно ускоряет процесс. Источники информации 1. Ильин В.Б, Гармаш Г.А., Гармаш Н.Ю. Влияние тяжелых металлов на рост, развитие и урожайность сельскохозяйственных культур // Агрохимия. - 1985. -6. - С. 90-100. 2...// . - 1964. - .18. 1. - .70-84. 3. Патент 2007071, МПК 701 7/00, 1994 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3