Способ исследования окисления этанола в головном мозге животных

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКИСЛЕНИЯ ЭТАНОЛА В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Зиматкин Сергей Михайлович Бубен Александр Леонидович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(57) Способ исследования окисления этанола в головном мозге животного, включающий газохроматографическое определение убыли этанола и накопление ацетальдегида в пробе,отличающийся тем, что в качестве пробы используют перфузат, который собирают прижизненно из большой цистерны мозга наркотизированного животного после стереотаксического введения ему этанолсодержащего перфузионного раствора в боковой желудочек мозга. Изобретение относится к области биохимии, а именно к аналитической биохимии, и может использоваться для оценки интенсивности и динамики прижизненного метаболизма этанола в головном мозгу лабораторных животных. Наиболее близким к заявляемому является способ определения окисления этанола в гомогенатах головного мозга крыс (Патент РБ 5490, МПК 01 33/48, 2003). Сущность способа заключается в газохроматографическом определении убыли этанола и накоплении ацетальдегида в исследуемых образцах, получаемых путем перфузии мозга, гомогенизации его образцов, преинкубации и добавления этанола. Недостатками этого метода являются 1) только посмертное определение окисления этанола в мозгу ( ) 2) невозможность многократного исследования окисления этанола у одного животного (в динамике). Задача изобретения - обеспечить возможность определения интенсивности и динамики прижизненного окисления этанола в головном мозгу животных. Поставленная задача решается путем газохроматографического определения убыли этанола и накопления ацетальдегида в исследуемых образцах. При этом отличительным моментом является то, что образцами являются пробы перфузата, получаемые прижизненно из большой цистерны мозга наркотизированного животного после стереотаксического введения ему этанолсодержащего перфузионного раствора в боковой желудочек мозга. Способ осуществляют следующим образом. Под общим наркозом животных (лабораторные крысы) помещают в стереотаксический аппарат, делают надрез мягких тканей головы, с помощью портативной бормашины просверливают черепную коробку, следуя 10107 1 2007.12.30 координатам стереотаксического атласа мозга крысы. Через отверстие в боковой желудочек мозга вводят иглу, соединенную с фторопластовой трубкой, через которую с помощью шприца и микронасоса с постоянной скоростью вводят раствор этанола нужной концентрации в 0,9 растворе . Вторую иглу вводят в большую цистерну мозга, а соединенную с ней фторопластовую трубку помещают в эппендорфовскую пробирку для сбора проб перфузата таким образом, чтобы конец трубки был погружен в ацетальдегидсвязывающий охлажденный раствор, предварительно налитый в пробирки. Каждую пробу собирают в течение 5 мин. Длительность исследования 60-90 мин или более, при необходимости. Точное количество перфузата в каждой пробе высчитывают по разнице в весе пробирки до и после взятия пробы. Содержание этанола и ацетальдегида в перфузате определяют газохроматографически. В каждой пробе определяют разницу между уровнем этанола и ацетальдегида в исходном (до начала перфузии) и конечном (после прохождения через мозг) перфузионном растворе. Полученные показатели позволяют объективно судить о процессах метаболической переработки этанола и ацетальдегида в головном мозге. Для иллюстрации полученных результатов приводим данные по содержанию этанола и ацетальдегида в перфузате в динамике в течение 90 мин, при исходной концентрации этанола в перфузионном растворе 100 мМ и скорости перфузии 12 микролитров/мин. Содержание этанола и ацетальдегида в перфузионной жидкости при прижизненной вентрикуло-цистернальной перфузии мозга крысы.пробы п/п (временной Содержание этанола Содержание ацетальдегида интервал 5 минут) в перфузионной жидкости (мМ) в перфузионной жидкости (мкМ) К 129,6985714 0 1 1,14 20,94 2 4,4 28,78181818 3 4,842105263 32,88421053 4 5,647058824 37,68235294 5 4,817272727 37,7113 6 4,751764706 40 4,374418605 38,00521 7 8 2,647567568 34,26486486 9 3,268421053 35,58947368 10 4,399090909 35,22356 11 6,049333333 35 12 6,482790698 35,712111 13 7,482857143 36 14 7,56625 35,6625 15 8,266666667 30,93333333 16 8,4 31,53333333 17 9,259090909 34,40454545 18 9,386666667 33,94666667 На фиг.1 показано содержание этанола в пробах перфузионной жидкости, полученных с временным интервалом 5 мин. На фиг. 2 показано содержание ацетальдегида в тех же пробах. Из таблицы видно, что оттекающая из мозга крысы перфузионная жидкость действительно содержит ацетальдегид, что свидетельствует о его образовании там, а также содержит значительно сниженное (по сравнению с контролем) количество этанола, что также свидетельствует о его активной переработке и метаболическом превращении. 2 10107 1 2007.12.30 Таким образом, предлагаемый способ действительно позволяет определять интенсивность прижизненного окисления этанола в мозгу, не нанося значительных повреждений головному мозгу и исключая, таким образом, привнесение сторонних факторов, могущих оказать существенное влияние на исследование метаболизма. Многократное в течение длительного времени взятие проб перфузата позволяет изучать процесс прижизненного окисления этанола в мозгу в динамике. Это позволяет более полно и объективно судить о тонкостях метаболической переработки этанола в головном мозге и изучать динамику окисления этанола как единственного фактора воздействия, так и в комплексе с другими метаболически активными соединениями. Способ достаточно надежен и хорошо воспроизводим. Он может быть использован в любой биохимической лаборатории, оснащенной газовым хроматографом, стереотаксическим аппаратом и микронасосом. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3