Способ определения метаболизма этанола в головном мозге животных

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ЭТАНОЛА В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ(71) Заявители Государственное высшее учебное учреждение Гродненский государственный медицинский университет Институт биохимии НАН Беларуси(72) Авторы Лиопо Антон Валерьевич Зиматкин Сергей Михайлович Захаров Олег Юрьевич(73) Патентообладатели Государственное высшее учебное учреждение Гродненский государственный медицинский университет Институт биохимии НАН Беларуси(57) Способ определения метаболизма этанола в головном мозге животных, включающий перфузию мозга, гомогенизацию его образца, преинкубацию, добавление этанола и газохроматографическое исследование, отличающийся тем, что после добавления этанола пробу разделяют на две равные части, в одну из которых добавляют депротеинизирующий раствор сразу, а в другую - после окончания инкубации, после чего определяют разницу между уровнем этанола в этих частях, по которой судят о количестве метаболизированного этанола. Изобретение относится к области биохимии, а именно к аналитической биохимии, и может использоваться для оценки интенсивности метаболизма этанола в головном мозге. Наиболее близким к заявляемому является способ исследования метаболизма этанола в гомогенатах головного мозга крыс по накоплению в них продукта метаболизма этанола ацетальдегида ( ,,., 1998. .22. - .8. . 1623-1627). Способ включает перфузию мозга, гомогенизацию его образцов, преинкубацию в течение 10 мин, инкубацию в присутствии этанола и газохроматографическое определение накапливающегося в ткани ацетальдегида. Недостатками этого способа являются 1) метаболизм этанола оценивается косвенно,по накоплению в ткани его первого метаболита - ацетальдегида 2) метаболизм этанола оценивается приблизительно, поскольку большая часть образующегося в процессе метаболизма этанола ацетальдегида быстро окисляется в ткани мозга до ацетата, а также свя 5490 1 зывается белками, фосфолипидами, биогенными аминами и другими химическими компонентами мозга. Задача изобретения - повышение точности определения этанолметаболизирующей способности ткани головного мозга. Поставленная задача решается путем определения разницы между уровнем этанола в гомогенате мозга, где метаболизм этанола подавлен химическим путем, и уровнем этанола в другой половине того же гомогената, которая инкубируется без подавления метаболизма этанола. Способ осуществляют следующим образом. Животных (беспородных белых крыссамцов гетерогенной популяции, массой 180-220 г) под эфирным наркозом перфузируют через сердце 300-400 мл охлажденного изотонического растворас гепарином (1000 ед/л). Затем мозг быстро извлекают, промывают в этом же растворе и замораживают в жидком азоте. Образцы мозга взвешивают и 10 гомогенаты готовят на холоду в стеклянном стакане с тефлоновым пестиком, используя охлажденный 0,1 М калий фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий).Тритон Х-100. Гомогенаты хранят при 4 С и исследуют в тот же день. 1 мл гомогената помещают в герметичные стеклянные флаконы объемом 15 мл и преинкубируют 20 мин в присутствии 10 мМ глюкозы. После преинкубации,не нарушая герметичности, в пробу добавляют 1-50 мМ этанол и разделяют пробу на две равные части - в одну часть добавляют депротеинизирующий раствор (контрольная проба), а другую часть продолжают инкубировать как опытную пробу в течение 30 мин при 37 , после чего реакцию останавливают. Реакцию останавливают добавлением депротеинизирующего раствора, содержащего 1,6 М НСО 4, 0,4 ЭДТА, 13 мМ тиомочевины и 3 мМ семикарбазида с 1 мМ 1-пропанолом, используемым в качестве внутреннего стандарта. Затем пробы выдерживают на холоду (4 ) в течение 60 мин, после чего инкубируют при температуре 65 в течение 20 мин. Затем 2 мл парогазовой фазы вводят в газовый хроматограф. Для определения количества метаболизированного тканью мозга этанола высчитывают разницу между уровнем этанола в опытной и контрольной пробах. Содержание белка в гомогенатах определяют по общепринятому методу. .(1951), используя сывороточный альбумин быка как стандарт. Единица измерения количества метаболизируемого этанола наномоль этанола/мг белка/ч. Для иллюстрации полученных результатов приведены данные по метаболизму этанола в мозге крысы при различных исходных концентрациях этанола в пробе (таблица). Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом способ позволяет прямо, по убыли этанола в образце, оценивать интенсивность его метаболизма в ткани мозга разделение каждой пробы после добавления этанола на две равные части позволяет повысить точность способа и учесть возможное неферментативное исчезновение этанола из образца. Способ прост в осуществлении, достаточно надежен и хорошо воспроизводим. Может быть использован в любой биохимической лаборатории, оснащенной газовым хроматографом. 5490 1 Показатели метаболизма этанола в гомогенатах мозга при инкубации проб в течение 30 мин при различных исходных концентрациях этанола в пробе Исходная концентрация этанола в пробе, мМ 1 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3