Способ получения лейкоцитарного интерферона

ных в 1 л воды (РЕЗ). и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ Трис-Н С (рН 7,5). 1 мМ Эдтук(ТЕ-буфер). 2 додецилсульфата натрия (ДСН) в делительную воронку емкостью 50 п. Прибавляют пронаэу к 200 дн г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч при комнатной температуре. Прибавляют 10 отсч./мин 125 -глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2 М Трио-НС (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема (120 объемн). и смесь экстрагируют при энергичном Перемешивании 15 л повторно первгнанного фенола в течение ТО мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин. После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу. всего 19,1 л объединяют с 60 г ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водноифазьа 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5.5) и 2 объемами этанола.После хранения в течение ночи при 20 С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито. Этот материал затем перемешивают с 200 мл ТНЕ (50 мМ Трис-НС (рН 7.5). 100 мММаСь 5 мМ ЭДТУК). содержащего 0,5 ДСН, Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора. Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуга Сорволл НС-З в течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл ТН Е. содержащего 0,5 ДСН. Оба раствора ТНЕ объединяют. экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 7 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК.Полин) РНК смеси выделяют адсорбцией на слигошпцеллюлозе. Прибавляют 2,7 г олиго(оТ)целлюлсзьп к 500 мл. После перемешивания в течение часа при комнатнои температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(оТ)целлюлозе. центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК,связанных с ней. промывают один раз 50 мл ТНЕ и второй раз 15 мл ТНЕ. Затем связанную поли(А)РНК алюируют пятью последонательными промывками 2 мл Н 2 О. Получают 860 и г полтгА)РНК. Надосадочный раствор РНК из песвои адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции. При второй я третьей адсорбциях получают 600,1 г и 1 Т 0 ц г РНК.РНК испытывают че ЧвИФН-а активность путем инъекции а ооциты Хепорив аеуЕ 5 РНК растворяют 515 мл Трио-Н С (рН 7,5), 88 мМ МаС 1 (ТНКбуеер), чтобы получить концентрацию около 1 чг/мп. Иньецируют 50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов.Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера п трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1.5 мл а 0.5 мл 52 мм трио-глицеринового буфера (рН 8.9). Смесь центрифугируют в течение 2 мин в центрифуга Эппендорфа, надосадочньпй слой сливают и замораживают при-20 С для испытаний. Одна единица ИФНа снижает количество вируса на пластине на 50. Активность препарата ИФН-сс выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19. Экстракт ооцитов имеет активность 300 Ш ИФН-а на д г РНК. при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РНК добавляют 0,5 М зтилендиаминтетрауксуснои кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 мМ ЭДТУК. Полученныи раствор экстрагируют дважды равным объемом ТН Е-насыщенного фенолом и 5 раз- равным объемом эфира. Затем его пропускают через колонкус 0.1 мл, нагре гую за 90 с до 100 С. и слоем в 13 мл с градиентом саха роэы 5 23. содержащей 50 мМ Триснсг (рН 7.5). 1 мм эдтук, 0.2 м наст. в качестве маркера добавляют 10000 спм 55 концевого 32 р-меченык фрагментов ДНК. произведенных при одновременном усвоении рВП 322 и эндонуклеаа Нйпо Н и Ре . Центрифугирование проводят в 5// 40 роторе при 1 ОС и 35000 об/мин в течение 16 ч. Фракции (0,6 мл) собирают с градиентом ЕЗСО коллектором при 1 мл/мин. Испытывают фракции на ЧеИФН-амРНК. их положение по отношению кл Р-ДНК маркерам. При последующем центрифугировании фракции. содержащие ЧеИФН-а мРНК. идентифицируют относительно маркеров. Фракции с активностью ЧеИФН-а мРНК. содержат 80 и г поли(АРНК. Их смешивают с 2 объемами ТНЕ, содержащего 0,5 ДСН и 0.02 поливинилсульфата ( последних приготовлениях поливинипсульфат был исключен, при этом применяют колонку с 50 и л олиго(оТцеллю.чозы. После промывки колонки 40 и г смеси РНК элюирукьт 4 промывками 0.6 мл дистиллированной воды. После осаждения этанолом РНК растворяют в 1 мг/мл в 0,5 мМ ЭДТУК. Испытание на активность ЧеИФН-а мРНК проводят. как описано выше. на порции осадка поли(А)РНК. Он имеет удельную активность 3600 Ш интерферона/ш. Следовательно. градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно (О-кратно по отношению к ЧеИФН-а мРНК. Получают приготов до д,пение с примесн т 40-кратным обогащением.Синтез с ДНК смеси. содержащей ЧеИФН-ас ДН К. Поли(А)РН К. обогащенную ИФН-а мРНК. используют в качестве шаблона модели) для получения однониточной комплементарной ДНК(ДНК). 800,11 л реакционной смеси содержит 40 мм Трио-НС (рН 7.5130 мм Маш. 5 мм М 9 СБ 2. 0.5 мм ДТТ, 20 мг/мл олиго(сТ)12 18. 5 мМ ЦСТР. бСТР и оТТР,5 мм 32 Р-оАТР (НЕН. удельная активность 10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и 280 ед. обратной транскриптазьт. После инкубации в течение 1 ч при З 7 С прибавляют0.5 М ЭДТУК и 20 ДСН (перекристаллизо ванного) к 10 мм ЭДТУК и 01 ДСН. Смесь экстрагируют 1 объемом фенола (перегнанного). Фенольную фазу промывают 200 Аи л 200 мм Трио-НС (рН 7,5). 1 мм ЭДТУК и 0,1. СДН. объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматогоафируют на колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в ТНЕ. Собирают фракции по 0.1 мл при 0.3 мл/мин. Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова). объединяют и прибавляют ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С образцы центрифугируют. отбрасывают надосадочный слой. Осадок растворяют в 180,14 л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа. Прибавляют 20 и л БММаОН и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин. Прибавляют 20 мл 5 м ацетата натрия. 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола. После охлаждения в течение ночи при -20 С собирают полученный осадок центрифугированием при силе. эквивалентной 10000 кратной силе тяжести (10000 х 9) в течение 20 мин при 0 С. Выход однониточной сДНК составляет 1011 г.Однониточный продукт сДНК находит- .ся в реальной сложной смеси большого числа различных сдНК. транскрибированных из соответствующих мРНК. имеющихся в смеси поли(А)Р-К. Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-а . например ННРМ-а сдНК.Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2-ном геле агарсзьл с использованием 30 мм Магрн. 2 мм ЭДТУК в качестве электролита. 2 Р-сДНК имеет длину 600 1000 нуклеотидов. относящихся к однониточному глобину СДН К. 32 Р-мече 50ные фрагменты ДНК используют в качестве маркеров размера.П р и м е р 2. Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК полимеразой 1. осажденную однонитевую сДНК растворяют в 20014 л Н 20. нагретой до 100 С. в течение 2 мин и инкубируют а 500,11 л 0.1 М нагретого денатурированного калийфосфатного буфера (рН 6.9) 10 мм гидов. 10 мм ДТТ. 1 мм каждого из оАТР. астр и астр. 1 мм Зн-атгв (н ан. удельная активность 100000 спм/нмоль) и 150 ед./мл Есо 1 ДНК полимеразы т. После 6.5 ч при 15 с прибавляют 0.5 эдтук и 20 дсн к 10 мм ЭДТУК и 0,1 ДСН. Затем смесь экстра гируют 500 сел фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250 ил 20 мм Трио-Н СЕ(ОН 7151. 5 ММ ЭДТУК (ТЕ буфер). Обе водные фазы объединяют и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс 63-100 в- вех же самых условиях. Прибавляют ЗМ ацетат дТдия к 0.3 М и 2.5 объемам этанола. смешит вают для осаждения ДНК. Всего собирают 13 иг ДНК.ДНК обрабатывают нуклеазой 51. Осажденную ДНК растворяют а 250 мл буфера(0.2 М МаСЛ. 50 мм ацетата натрия рН 4.5). 10 мм сульфата цинка и нагревают при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют 1.5 Цп 3 ФЕРМВНТЗ (11 едИнИЦ/ ул). смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Прибавляют ДСН и ЭДТУК к 0,1 ДСН и 5 мм ЭДТУК и экстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 цЕТЕ буфера. Обьединяют водные фазы и хроматографируют на колонке с Сефадексом 3-100 в ТНЕ. ссбирают фракции по 0.1 мл при скорости 0,3 мл/мин и определяют радиацию Черенкова для каждой фракции. После осаждения из этанола и ацетата натрия собирают-дул г двойной спирали ДНК.(в частности. рВН 322) эндонуклеаэой Рзт 1 и добавляют сЮМР хвосты концевой трансферазой. вомв добавляют к 5 концу плазми ды для регенерации Ре сайта и лигируют с сДНК фрагментом. несущим комплементарные хвосты. Двунитевую сдН К удлиняют ПРИ добавлении осмР хвостов к З концевому. Затем плазмиду и сдНК обрабатывают пигазой. чем обеспечивается введение сдНК в подходящий сайт плазмидьз и получение гибридной ДН К.П р и м е р 4. Плазмиду рВН 32-2 (20 г) гидролизуют 21 единицами Ре 1 знзонуклеазы а 150 мл 10 мм Трио-НС (рН 7.516 мм МоСо. 50 мм МаСЕ. 6 мм мосш. 50 мм Маш,б ММ -Меокаптоэтанола. 200 мг/ил бычьего сывороточного альбумина (БСА). После 2 чпри 37 С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (11) и 1 объемом эфира и осаждают этанолом.Добавление гомополимерных хвостов СЮМР с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансфераэы ггат) осуЩеСТВПяЮт в 328 мл реакционного объема. содержащего 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2). 10 мМ МаН 2 РО 4. 5 мМ М 9 С 2. 1 мМ оБТР. 50 мг/мл БСА и 3 6 ед. ТоТ (очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при 37 С в течение 20 мин. Прибавляют ЭДТУКк 10 мм смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня Против буфера ТН Е.двунитевую ДНК удлиняют остатками оСМР по стандартной методике. Инкубируют 150 мл двунитевой сДНК. описанной выше. а 8 Цл 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2). 2.5 мМ Соси. 50 иг/мл БСА 0.2 мМ астк содержащего 3 6 ед. очищенного ТоТ на мг ДНК. в течение 8 мин при 27 С. а затем замораживают л ри -2 ОС.Инокулируют одну колонию Е.со 177 б в 100 мл триптоновой среды сдобавкой 100,1 г/мл диаминопимелиновой кислоты. 10 и г/мл налидиксовой кислоты и 10 иг/мл тетрациклина. Выращиваюткультуру при 37 С до кажущейся оптической плотности 0.6 при 650 нм (Одвво) и охлаждают на льду в течение 30 мин. Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе. клетки промывают 50 мл 10 мм МаСД отделяют намл 1 ОО мМ СаСЬ. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин. центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ СаСЕ 2 и хранят на льду в течение ночи для использования. Аликвоты (0.5 мл) хранят замороженными при -70 С.Смешивают 3 нг оСМР-удлиненной ДНК с 22 нг оСгИР-удлиненной Рзт . обраЭотанной рВН 322 в 50 мл ТНЕ-буфера. Инкубируют при четырех последовательных стадиях при 65. не. 37 и 20 С. Прибавляют 20 ил 100 мМ Трио-НС (рН 7.5). 100 мМ СаС 2. 100 мМ М 9 С 2 и 50 ил ТНЕ буфера.смесь охлаждают на льду 20 мин.Рекомбинантные молекулы РНК добавляют к 100 ил обработанных Са клеток Е.со 1 и смесь охлаждают на льду в течение 20 мин. нагревают до 20 С в течение 10 мин и прибавляют 0.6 мл триптоновой среды. Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой. подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфокции составляет 333-104 колоний на мг зака ленной рВН 322 трансфециэованной ДНК, нативная рВН 322 дает 3 -10 колоний науиг.Так как плаэмида рВН 322 включает ген устойчивости к тетрациклину. Е.со 11 реципиент. который был трансформирован плазмидой. будет расти в культуре. содержащей такой антибиотик. в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий. Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию органиамов-хоэяев. трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором.После 48 ч при 37 С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной. как описано выше) в углублениях микротитерных пластин. После инкубации при З 7 С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40-ного глицерина. Пластины выдерживают при -20 С и готовят набор из 100000 индивидуальных клонов трансформированной Е.со 1 Х 1776.П р и м е р 4. Рекомбинантные молекулы ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК. содержащими ИФН-СсмРНК Гибриды рекомбинантных молекул ДН К-поли(А)РНК отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия С). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают (стадия Д). выделенную РНК испытывают на активность ИФН-амРНК (стадия Е). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов. способной гибридиэироваться с поли(АРНК в жестких условиях гибридизации. а также вызывает образование ИФН-ав ооцитах. Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировы вают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают. Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифициРОБЗН единичный клон. Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-а.Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой. После инкубации при 37 С каждый клон разрастается в колонию несколько миллиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин И собирают. получают инокулум, использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей. как описано выше, 2 л колбу Эрленмейера. Культуру встряхивают при 37 С до появления Одвво примерно 0.8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170 иг/мл прибавляют к культуре. которую снова встряхивают при 37 С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформаи культуру снова встряхивают 10 мин при37 С. чтобы удагитчддбагтерии. Культуру де, кантируют с хлороформом, клетки собирают центрифугированием в течение 15 минмерно 1 е 2 г клеток из каждого литра ред-деп туры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 мМ Трио-НС (рН 7.5). центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4 С. повторно суспендируют в 30 мл 50 мм Трис-Н С (рН 7.5). Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трио-НС (рН 735. после охлаждения в течение 10 мин при 0 С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-НШ-культур). 0.5 М ЭДТУК (рН 8.0). осторожно перемешивают без встряхивания. Еще через 10 мин при 0 С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2 Тритона Х 100. Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0 С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют 3 М аОН при перемешивании до тех пор. пока не будет достигнут рН 12.5. измеряя при 20 С используя стеклянный электрод и рН-метр. стандартизированный стандартным карбонатным Буфером Бекманн рН 10 (Мг 3505). После перемешивания в течение 10 мин при 20 С устанавливают рН 8.5. После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5 М ЫаС и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного 9.5 М МаСЕ) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0 С в течение 10 мин. Надосадочньхй слой. содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК). осторожно удаляют из промежуточной фазы(которая содержит однониточную ДНК и З раза экстрагируют хлороформом. (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии). Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантньле молекулы ДНК (рВН З 22-сдНК вставка). первоначально использованные для трансформации этих клеток организмареципиента. которые образуют часть 512 кленов. выбранных для испытания. Прибавляют панкреатическую РНКззуА(5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85 С) к форме 1 ДНК до концентрации 20 г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37 С. Прибавляют 1/5 объема 5 М МаС иусмесь обрабатывают 30 полиэтиленгликолем 6000 до окончательной концентрации 75 ПЭ Г. После 2 16 ч при-1 ОС собирают осадок в роторе в течение 20 мин при 8000 об/мин И 0 С растворяют в 0.075 М гаС. 0.0075 М цитрата натрия до0,5 ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при З 7 С с 0.5 мг/мл дпдрдзназьх (20 мг/мл. 2 ч при 37 С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа. Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23 в 50 мМ Трис-НС рН 7,5) 1 мМ ЭДТУК. в течение 15 ч при 21000 об/мин и 15 С. Собирают фракции и контролируют Од 2 б 0. Собирают фракции. содержащие ДНК. и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 ТООуиг смеси ДНК.20 дг ДНК обрабатывают в 150 нл 10 ММ Трис-НС (рН 7.5). 6 ММ М 9 С 2. 50 ММ МаСЪ 6 мМ 2-меркаптоэтанола. 200 Цг/мл БСА или желатина и 20 единиц Нйпс . Эндонуклеазой Нпс расщепляют плазмиду рБВ 322. После 2 часов при 37 С аликвоты 0) подвергают электрофорезу на 1 агарозном геле в 50 мм трио-ацетата (рН 7.8), 2 мм ЭДТУК в течение 1 ч при 50 гид. чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще Нйпс и продолжают инкубацию еще 2 ч. Когда ДНК полностью расщеплена. прибавляют проназу. ЭДТУК и ДСН в количествеПосле 30 мин при 37 С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (121). Промывают 50 ил р-ра 20 мм Трис-НС (рН 7.5). 1 мМ ЭДТУК объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром. фильтруют через колонку 0.1 мл. обработанную ЭДТУК. и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2.5 объемами этанола. После хранения в течение ночи при -20 С ДНК собирают центрифугированием. Готовят две гибридизирующие смеси. Смесь содержит дул Ю-кратно концентрированного буфера (дм МаСд 0.1 ПИПС (он 6.4. 1 Фпиперазиндиэтансулъфокислота). 50 мм ЭДТУК. 0.5 ил (около 5 нг тд-тсбьтн мРНК (5000 спм) и б мл индуцированной лейкоцитарной пол и(АР-К (2 иг/ дл). Смесь 1 содержит 10 иг обработанной Нпс ДНК и 0.1 мг Р 5 т-2-рВН 322 (Н 3)Нс ВСЕ 4013 ДНК(производная рВН 322. которая содержит последовательность Б-глобина в Нйпс сайте). Обе смеси сушат в парах газообразного азота. Прибавляют 4 С мл 80 формамида к остатку смеси и денатурируют раствор в течение 10 мин при С 0 С и быстро охлаждают нз льду. денатурированный раствор используют для растворения смеси . а полученный раствор инкубируют при 5 бС а течение 4 ч.После разбавления до 1 мл холодным 0.9 М МзС. 0.09 М цитратом натрия и 100 1,