Способ получения биопрепарата, повышающего продуктивность ячменя пивоваренного

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА, ПОВЫШАЮЩЕГО ПРОДУКТИВНОСТЬ ЯЧМЕНЯ ПИВОВАРЕННОГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Алещенкова Зинаида Михайловна Суховицкая Людмила Антоновна Сафронова Галина Владимировна Мельникова Наталия Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)11555 1, 2009. БАШКОТ Е.Н. Формирование продуктивности ярового пивоваренного ячменя в зависимости от применения химических и биологических препаратов Автореф. дис. - Ставрополь, 1997. С. 17-19. НЕСТЕРЕНКО В.Н. Использование ассоциативных микроорганизмов для повышения урожайности ячменя и многолетних злаковых трав Автореф. дис. - Минск, 1993. - С. 21-23. МИХАЙЛОВСКАЯ Н.А. Международный аграрный журнал. - 1999. -11. С. 20-22.2129374 1, 1999.1316189 1, 1988.2051586 1, 1996.2100932 1, 1998.2111196 1, 1998.2226214 1, 2004.(57) 1. Способ получения биопрепарата, повышающего продуктивность ячменя пивоваренного, заключающийся в том, что штаммы. БИМ В-402 Д и. БИМ В-409 Д, взятые в соотношении 11, вносят в количестве 10 об.в мелассно-минеральную питательную среду, осуществляют их глубинное культивирование в течение 48 ч при температуре 28 С и аэрации 0,75-1,0 л воздуха на 1 л среды в минуту и получают консорциум указанных штаммов в культуральной жидкости с титром не менее 109 КОЕ/мл. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что консорциум дополнительно иммобилизуют на торфяном субстрате из расчета 60 г консорциума на 140 г торфяного субстрата при температуре 18-20 С в течение 72-96 часов. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности получению экологически безопасных микробных препаратов комплексного действия и представляет собой способ получения биопрепарата, обеспечивающего повышение урожайности и технологических свойств зерна пивоваренного ячменя. Основной задачей при возделывании пивоваренного ячменя является высокий выход зерна с низким содержанием белка, не превышающим 12 , поскольку при более высоком 14450 1 2011.06.30 его уровне осложняется переработка ячменя в солод, затягивается процесс брожения и повышается себестоимость пива. Традиционный способ возделывания пивоваренного ячменя основан на использовании минеральных удобрений и в частности азотных. При планировании урожайности пивоваренного ячменя более 50 ц/га дозы вносимого под посевы минерального азота составляют 80-90 кг/га, что усиливает рост вегетативной массы, повышает урожайность, однако, при этом качество получаемого зерна не удовлетворяет потребности пивоваренной промышленности, поскольку характеризуется высоким содержанием белка (более 12 ) 1. Вторым, наиболее значимым элементом питания при возделывании пивоваренного ячменя является фосфор. При внесении минеральных удобрений под пивоваренный ячмень придерживаются следующего соотношения- 11,52-2,5. Эффективность фосфорных удобрений зависит от содержания в почве его доступных элементов, так как ячмень интенсивно потребляет фосфор в первый период развития. В зависимости от планируемой урожайности дозы фосфорных удобрений варьируют в широких пределах (от 30 до 120 кг/га), а используется лишь 25 фосфора удобрений, что, с учетом их высокой стоимости, ведет к значительному удорожанию конечной продукции 2. Для повышения эффективности производства пивоваренного ячменя важной задачей является найти оптимальный вариант азотного и фосфорного питания, позволяющий повысить урожайность и при этом сохранить необходимые пивоваренные качества зерна. Один из путей решения данной проблемы - уменьшение доли минеральных азота и фосфора и частичной замены их биологическими, поступающими в растения при применении азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов. Особого внимания в этой связи заслуживает использование естественных и искусственных ассоциаций микроорганизмов и создание биопрепаратов на их основе. Интерес к изучению микробных ассоциаций в большей мере обусловлен общебиологическими понятиями одновидовые системы, как и монокультуры в сельском хозяйстве,неустойчивы по своей природе, поскольку в условиях стрессов сильно уязвимы для конкурентов, возбудителей болезней и т.д. - факторов оказывающих влияние на их функционирование в агроценозах. В сравнении с монокультурами микроорганизмов, преимущества ассоциаций азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий, не вступающих в антагонистические отношения между собой и взаимодополняющих друг друга, заключаются в постоянстве состава, повышенной эффективности и стабильности действия на растения,устойчивости к воздействию внешней среды и сапрофитных микроорганизмов. Все это позволяет их использовать в качестве основы новых комплексных биопрепаратов для бактеризации сельскохозяйственных культур 3. В области сельскохозяйственной биотехнологии известны штаммы и консорциумы ассоциативных микроорганизмов, предназначенные для бактеризации небобовых культур и способы получения микробных препаратов на их основе. Известен штамм азотфиксирующих бактерийВ-4485 4 для обработки семян зерновых культур и многолетних злаковых трав с целью повышения их урожайности. Недостатком данного штамма является отсутствие антимикробного и фосфаттрансформирующего эффекта. Известен штаммАР, предназначенный для повышения урожайности свеклы 5. Штамм обладает фосфатмобилизующей и ростстимулирующей способностью, но эффективен на узком спектре сельскохозяйственных культур (овощные и корнеплоды) и неспособен к биологической азотфиксации. Известен штаммдля получения микробного препарата для борьбы с болезнями пшеницы и повышения урожайности 6. Недостатком данного азотфиксирующего штамма является отсутствие антибактериального и фосфатмобилизующего действия. 2 14450 1 2011.06.30 Известен консорциум из 4-х штаммов почвенных бактерий-антагонистов 8 и способ получения на их основе препарата против бактериальных и грибных болезней растений. Действие консорциума ограничено только подавлением фитопатогенов. Известна ассоциация из 3-х штаммов бактерий родадля получения биопрепарата и способ его получения 9, заключающийся в раздельном культивировании бактерий ассоциации, дальнейшем смешивании культуральных жидкостей в разных соотношениях и внесении различных наполнителей. Известен препарат, содержащий 2 штамма бактерий рода 10. Действие препарата ограничено только стимулирующей рост растений активностью. Известен препарат, содержащий в своем составе композицию 3-х штаммов бактерий рода , которая обладает фунгицидным действием против фитопатогенных грибов рода 11. Недостатком данного препарата является то, что он применяется как фунгицид по отношению к грибам одного рода и не имеет антагонистического воздействия на бактериальные фитопатогены. Известен биопрепарат для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур 12, включающий нетрадиционную композицию из 5 живых микробных культур, выделенных из разных экосистем (почвы, ризосферы растений, воды и грунта озер Прибайкалья). Препарат представляет собой культуральную жидкость, содержащую микробные клетки компонентов в разных соотношениях и продукты их метаболизма. Недостатком препарата является сложная технология получения конечного продукта. Известен биопрепарат Клепс для питания и защиты растений, содержащий смесь живых культурив количестве 90,0-99,9 по объему и 0,1-10,0 соответственно 13. Общими недостатками известных консорциумов микроорганизмов и способов получения биопрепаратов на их основе являются узкий спектр хозяйственно-полезных свойств у штаммов, являющихся основой препаратов (в частности, отсутствие нитрогеназной и фосфатмобилизующей активности) отсутствие данных о влиянии известных штаммов и консорциумов на развитие растений пивоваренного ячменя разных сортов трудоемкость приготовления среды для выращивания микроорганизмов и высокая стоимость ее компонентов многоступенчатость получения препарата в связи с раздельным культивированием штаммов, входящих в ассоциации длительность процесса культивирования недостаточно высокие титры культур и неравновесное соотношение их в конечном продукте вызывает сомнение перспективность использования известных искусственных ассоциаций в практике в связи с отсутствием данных о способности бактериальных штаммов,входящих в ассоциации, колонизировать корневую систему растений - свойстве, наиболее обусловливающим эффект инокуляции. использование известных препаратов под узкий спектр сельскохозяйственных культур. отсутствие важной характеристики в связи с практическим применением штаммов и консорциумов микроорганизмов - их устойчивости к пестицидам, широко использующимся при подготовке семян зерновых к посеву (протравливание). Указанные недостатки приводят к неполному использованию преимуществ бактеризации и вызывают необходимость поиска новых штаммов ассоциативных ризобактерий,обладающих хозяйственно-ценными признаками, и разработке способов получения комплексных бинарных препаратов на их основе, обеспечивающих эффективное использование бактеризации в практике растениеводства. Известен штамм ассоциативного диазотрофа 5 и препарат Ризобактерин на его основе для повышения азотнакопительной способности и урожайности зер 3 14450 1 2011.06.30 новых культур на фоне снижения доз вносимых минеральных азотных удобрений 14. Недостатком данного технического решения является его основное назначение - повышение азотнакопительной способности зерновых культур, что недопустимо в отношении качества пивоваренных сортов ячменя. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является использование для повышения урожайности растений штамма бактерий. В 402 Д с неспецифической ростстимулирующей, азотфиксирующей, фосфатмобилизующей активностями 7. Недостатками прототипа являются слабовыраженная антибактериальная активность сравнительно невысокая способность к мобилизации трудно растворимых фосфатов. Задачей предлагаемого изобретения является разработка экономичного и быстрого способа получения биопрепарата, содержащего взаимодополняемую бактериальную ассоциацию с широким комплексом хозяйственно-полезных свойств (азотфиксация, фосфатмобилизация, ростстимулирующая и антагонистическая активности) с целью повышения урожайности пивоваренного ячменя, защиты от болезней, частичной замены минеральных азотных и фосфорных удобрений и получения зерна с высокими технологическими свойствами, отвечающими ГОСТ 5060-86. Поставленная задача решается за счет использования в качестве основы препарата консорциума штаммов бактерий. В-402 Д и. В-409 Д (соотношение 11) применения рационального способа глубинного культивирования бактерий в ферментере объемом 100 л на оптимизированной мелассно-минеральной среде при следующих параметрах культивирования 28 С, аэрация - 0,75-1,0 л воздуха/л среды, время культивирования - 48 ч, количество вносимого посевного материала - 10 от объема среды,обеспечивающие получение жидкого препарата с общим титром жизнеспособных клеток бактериальных компонентов, соответствующим данным лабораторного регламента и ТУ 1002890066.046-2009 (5,1 млрд. КОЕ/мл) оптимизации препаративной формы путем иммобилизации на торфяном субстратеносителе. Предлагаемое техническое решение не является очевидным, так как данный консорциум был получен в длительном экспериментальном подборе штаммов ризобактерий, в результате которого удалось найти заявляемый консорциум энтеробактерий, отвечающий требованиям производства пивоваренного ячменя и получения зерна с высокими технологическими свойствами. В заявляемом способе подобранные экспериментальным путем штаммы консорциума характеризуются не только широким спектром взаимодополняемых физиолого-биохимических свойств, определяющих его хозяйственно-ценные признаки (ростстимуляция, биологическая азотфиксация и фосфатмобилизация, подавление как грибной, так и бактериальной фитопатогенной микрофлоры, высокая приживаемость в ризоплане растений и др.), но и отсутствием антагонизма при совместном культивировании, устойчивостью к действию протравителей зерновых культур, что позволяет использовать их в качестве основы бинарного микробного препарата комплексного действия. Характеристика штамма. В-402 Д приводится в патенте Патент ВУ 11555. Характеристика штамма. В-409 Д. Штамм хранится при 4 С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2 перевивка - 1 раз в три месяца. Культурально-морфологические особенности. Колонии на мясо-сусло агаре на 2-3 сутки роста кремовые, на МПА и средах, содержащих дрожжевой экстракт, чуть желтоватые, слизистые, слегка выпуклые, блестящие,4 14450 1 2011.06.30 непрозрачные, край колоний ровный. На средах, содержащих сахара, отмечается обильное образование слизи. Цитология грамотрицательные палочковидной формы клетки, концы палочек закруглены, диаметр - 0,8 . Палочки расположены одиночно, либо попарно. Клетки аспорогенны. Физиолого-биохимические особенности. Продуцирует индольные ауксины. Разлагает (гидролизует) желатин и крахмал не гидролизует. Другие оксидазоотрицателен, каталазаположителен, имеет положительные реакции Вогес-Проскауэра, с метиловым красным, на уреазу, окислительный и бродильный типы метаболизма глюкозы. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, лактозы, дульцита, мальтозы, ксилозы. Восстанавливает нитраты до нитритов. Особые свойства. Не нуждается в факторах роста. Обладает комплексом хозяйственно-ценных свойств ростстимулирующей, фосфатмобилизующей и антимикробной активностями. Условия культивирования среда (состав среды) а) среда мясо-пептонный бульон 250 мл сусло пивное - 250 мл вода - 500 мл агар-агар - 20,0 г б) среда Муромцева, содержащая, г/л глюкоза - 10,0 аспарагин 1, 24 - 0,2 472 - 0,2 кукурузный экстракт 0,2 агар - 20,0, затем вносят в расплавленную среду 3,3 г 262, 3,8 г 34122 температура 15 -37 С рН 6,0-7,0 время культивирования 2-е суток отношение к кислороду факультативный анаэроб. Практическая ценность штамма штамм обладает способностью стимулировать всхожесть семян пивоваренного ячменя разных сортов, трансформирует 25 из труднорастворимых фосфатов, может быть использован для получения бактериального препарата,обладающего высокой фосфатмобилизующей способностью, фитостимулирующим эффектом, выраженным антифунгальным и антибактериальным действием. Штамм. В-409 Д не фитотоксичен. Фитотоксичность проверена на растениях редиса традиционном биотесте, обладающем высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам. После обработки кончиков корней проростков редиса культуральной жидкостью бактерий. В-409 Д и выдерживания их в течение 3 суток в термостате (2224 С) отсутствия задержки в развитии, некротических пятен, ожогов и других изменений в сравнении с контролем (вода и стерильная питательная среда) не обнаружено, что свидетельствует о нетоксичности бактерий. В-409 Д для высших растений. Особенностью данного штамма в отличие от штамма, входящего в ассоциацию, является продукция вторичных метаболитов, подавляющих развитие фитопатогенных бактерий, а также более высокая фосфаттрансформирующая способность перевода нерастворимых соединений фосфорной кислоты в форму, доступную для растений. Патогенность штамма штамм. В-409 Д не является патогенным и токсикогенным для теплокровных животных. Штаммы энтеробактерий были выделены методом накопительной культуры и селекционного отбора из ризопланы ячменя. Штаммы непатогенны и депонированы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научной коллекции типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси), где им присвоены коллекционные номера БИМ В-402 Д и БИМ В-409 Д соответственно. 1. Факторы и условия адаптации и селекции. Селекционный отбор штаммов проводили по их ростимулирующему действию на энергию прорастания и всхожесть семян, длину и сырой/сухой вес проростков пивоваренного ячменя 5 сортов Атаман, Бровар, Бацька, Талер и Сябра. Из коллекционных культур ризобактерий по высокой ростстимулирующей активности на семенах пивоваренного ячменя отобраны штаммы. В-402 Д и. В 409. 5 14450 1 2011.06.30 Дальнейшую селекцию отобранных штаммов. В-402 Д и. В 409 Д проводили по хозяйственно-ценным признакам, определяя их способность к биосинтезу ИУК, нитрогеназную, фосфаттрансформирующую активность и антимикробное действие. 2. Соотношение и заменяемость индивидуальных компонентов. Соотношение штаммов в консорциуме. В-402 Д. В-409 Д 11. Замена одного из штаммов консорциума каким-либо другим штаммом ризобактерий, не заявленным в консорциуме, невозможна, поскольку один из штаммов консорциума является диазотрофом, а другой - обладает уникальной для энтеробактерий особенностью - способностью трансформировать фосфаты кальция, алюминия и железа и высокой антимикробной активностью. Заявленные штаммы обладают сравнительно одинаковой скоростью роста в мелассно-минеральной среде и отсутствием антагонизма при совместном культивировании, что позволяет получить целевой продукт - препарат Гордебак - с высоким титром и равновесным соотношением бактериальных компонентов. 3. Делимость. Для предпочтительной изоляции. В-402 Д из консорциума используют агаризованную среду Эшби, содержащую в г/л маннит - 20,0 24 - 0,2 472 0,2- 0,2 24-0,1 3 - 5,0. Для предпочтительной изоляции. В-409 Д из консорциума используют агаризованную глюкозо-аспарагиновую среду, предложенную Муромцевым, содержащую в г/л глюкоза - 10,0 аспарагин - 1,0 кукурузный экстракт - 0,2 24 - 0,2 472 0,2 агар - 20,0, рН среды которой до 6,8 доводили 10 раствороми методом осаждения вносили фосфаты алюминия, железа или кальция (0,570 г 3 41220,362 г 362 или 0,405 г 362 или 3,3 г 262). 4. Стабильность и/или конкурентоспособность. Консорциум штаммов стабилен и сохраняет свои свойства при длительном хранении в виде культуральной жидкости или в иммобилизованном состоянии на торфяном субстрате. Консорциум конкурентоспособен - способен сохраняться на торфяном субстрате в присутствии контаминирующей микрофлоры. 5. Физиологические особенности консорциума в целом. Консорциум характеризуется высокой и сравнительно одинаковой скоростью роста штаммов, а также отсутствием антагонизма при совместном культивировании в мелассноминеральной среде, что позволяет получить препарат с высоким титром (5109 КОЕ/мл),равновесным соотношением бактериальных компонентов (11) и комплексом хозяйственно-ценных свойств (азотфиксация, ростостимуляция, фосфатмобилизация и подавление грибных и бактериальных фитопатогенов). Преимуществом предлагаемого консорциума штаммов бактерий. В 402 Д и. В-409 Д является его устойчивость и стабильность, комплекс хозяйственно-ценных свойств. Кроме этого, фитопатогены подвергаются воздействию комплекса антимикробных метаболитов, вырабатываемых консорциумом энтеробактерий, что усиливает эффект их подавления. В-402 Д продуцирует вторичные метаболиты, подавляющие фитопатогенные грибы, а штамм. В-409 Д обладает существенной антибактериальной активностью. Важным преимуществом является устойчивость эктеробактерий к протравителям и способность консорциума штаммов колонизировать корневую систему культуры. Консорциум энтеробактерий не обладает фитотоксичностью, о чем свидетельствует отсутствие задержки в развитии, некротических пятен, ожогов и других изменений проростков редиса после обработки кончиков корней культуральной жидкостью консорциума штаммов бактерий. В-402 Д и. В-409 Д в сравнении с контролем (вода и стерильная питательная среда). 6 14450 1 2011.06.30 Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры. Пример 1. В ранней фазе роста, когда развивается зародыш, прорастает семя и формируется проросток, растение особенно чувствительно к условиям внешней среды. Именно в этот период легче обнаружить влияние различных факторов на растительный организм. На первом этапе исследований определяли ростостимулирующее действие. В-402 Д,. В 409 Д и их консорциума на энергию прорастания и всхожесть семян (табл. 1), длину (табл. 2) и сырой/сухой вес (табл. 3) проростков пивоваренного ячменя 5 сортов. Проведенные исследования ростстимулирующей активности показали, что, в сравнении с контролем,. В-402 Д и. В 409 Д обеспечивали повышение энергии прорастания семян пивоваренного ячменя в среднем на 40 , их всхожести на 42 , накопления сырой/сухой массы проростков - на 7/12 , их длины - на 14 . Консорциум энтеробактерий в повышал энергию прорастания в среднем на 67,4 , всхожесть на 85 , длину проростков на 30 , накопление сырой/сухой массы проростков ячменя на 26/34,5 . Не выявлена строго выраженная сортовая специфичность энтеробактерий, что позволяет использовать их в качестве ростостимуляторов на разных сортах пивоваренного ячменя. Таблица 1 Влияние. В-402 Д,. В-409 Д и их консорциума на энергию прорастания и всхожесть семян ячменя разных сортов Сорта ячменя Атаман Бровар Бацька Сябра Талер Варианты энергия всхо- энергия всхо- энергия всхо- энергия всхо- энергия всхопрорас- жесть, прорас- жесть, прораста- жесть, прорас- жесть, прорас- жесть,тания,тания,ния,тания,тания,Таблица 2 Влияние. В-402 Д,. В-409 Д и их консорциума на длину проростков ячменя разных сортов Сорта ячменя Атаман Бровар Бацька Сябра Талер Варианты к к к к к мм 14450 1 2011.06.30 Таблица 3 Влияние. В-402 Д,. В-409 Д и их консорциума на сырой/сухой вес проростков ячменя разных сортов Сорта ячменя Атаман Бровар Бацька Сябра Талер Варианты сырой/к сырой/к сырой/к сырой/к сырой/к сухой конт- сухой контро- сухой кон- сухой кон- сухой конвес, мг ролю вес, мг лю вес, мг тролю вес, мг тролю вес, мг тролю Пример 2. Хозяйственно-ценные свойства энтеробактерий-ростстимуляторов и их консорциума. Отселектированные по ростстимулирующей активности на пивоваренном ячмене энтеробактерии. В-402 Д и. В 409 Д обладают хозяйственноценными свойствами биосинтез ИУК, нитрогеназная, фосфаттрансформирующая активность и антимикробное действие (табл. 4, 5). Важными хозяйственно-ценными свойствами,взаимодополняющими друг друга в консорциуме. В-402 Д. В 409 Д, являются фиксация азота и фунгицидная активность штамма. В-402 Д, высокая фосфатмобилизующая активность и антибактериальное действие. В 409 Д. Консорциум энтеробактерий проявляет более высокие показатели этих свойств в сравнении с монокультурами. Таблица 4 Хозяйственно-ценные свойства энтеробактерий-ростстимуляторов Азотфиксирующая Продуци- Нитрогеназная акФосфатмобилизующая активность в ассорование тивность чистых активность, диаметр Штаммы циации с растениИУК,культур,зон растворения ортоем, нМоль мкг/мл нМоль С 24/фл./сут фосфатов, мм С 24/раст./сут. 19,00,06 2,30,21 135,13,50 10,5-12,4 В-402 Д. 15,80,07 16,7-18,3 В-409 Д Консорциум 19,40,05 4,10,18 186,34,23 19,3-21,2 энтеробактерий Таблица 5 Антимикробное действие энтеробактерий-ростстимуляторов Зоны ингибирования роста фитопатогенов, мм Штаммы 14450 1 2011.06.30 Пример 3. Для обеззараживания семян зерновых культур в настоящее время широко применяются такие пестициды, как раксил, дивидент, винцит, ламадор и кинто-дуо. Все исследованные протравители обладают бактериостатическим действием в отношении энтеробактерий и не ингибируют их развитие в течение двух суток культивирования с пестицидами (табл. 6). Высокая устойчивость энтеробактерий к токсическому действию протравителей предопределяет возможность использования их консорциума вместе с пестицидами в практике - при подготовке семян пивоваренного ячменя к посеву и подтверждает перспективность получения бинарного препарата на их основе. Таблица 6 Влияние протравителей в производственных дозах на рост. В-402 Д и. В-409 Д при глубинном культивировании в мелассно-минеральной среде Титр жизнеспособных клеток, КОЕ/млот конВариант опыта троля исходный титр через 48 часов. В-402 Д. В-402 Д без протравителей (контроль) 100 5,930,059107 5,310,152109 9. В-402 Ддивидент 90 4,810,14410 9. В-402 Двинцит 42 2,230,06910 9. В-402 Дкинто-Дуо 16 8,800,43610 9. В-402 Дламадор 94 5,000,07710 9. В-402 Драксил 95 5,060,11610. В-409 Д. В-409 Д без протравителей (контроль) 100 5,18 0,092107 6,470,107109 9. В-409 Ддивидент 94 6,080,11510 9. В-409 Двинцит 94 6,070,09310 9. В-409 Дкинто-Дуо 92 5,960,12210 9. В-409 Дламадор 91 5,890,09310 9. В-409 Драксил 99 6,390,15610 Пример 4. Свойство, наиболее обусловливающее эффект инокуляции ассоциативными азотфиксаторами растений - колонизирующая способность. Колонизирующую способность штаммов энтеробактерий изучали антибиотикорезистентным методом 15. Для изоляции. В-402 Д из консорциума использовали агаризованную среду Эшби. Для изоляции. В-409 Д из консорциума использовали агаризованную глюкозо-аспарагиновую среду. Согласно полученным данным (табл. 7), штаммы. В-402 Д и. В-409 Д обладают высокой колонизирующей способностью и сохраняются на корнях ячменя в течение основных фаз развития, что обусловливает эффект диазотрофной инокуляции. Пример 5. С целью подбора наиболее оптимальной питательной среды методом глубинного культивирования исследовали рост энтеробактерий на трех различных по составу и способу предварительной подготовки средах кукурузно-мелассной, мелассно-дрожжевой, мелассно-минеральной. Глубинное культивирование. В-402 Д и. В-409 Д проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл с 200 мл исследуемой питательной среды на лабораторной качалке (200 об./мин) при температуре 26-28 С. Показатели роста энтеробактерий на сравниваемых средах приведены в табл. 8. 14450 1 2011.06.30 Таблица 7 Колонизирующая способность штаммов энтеробактерий,(численность в ризоплане корней, млн КОЕ/г корней) Фазы развития ячменя Вариант опыта кущение выход в трубку колошение Контроль. В-402 Д 0,35 8,00 2,60. В-409 Д 0,23 9,04 3,33 Таблица 8 Глубинное культивирование. В-402 Д и. В-409 Д в жидких средах разного состава Титр жизнеспособных клеток, КОЕ/мл Среда культивирования 0 ч 24 ч 48 ч. В-402 Д Кукурузно-мелассная среда 4,870,157107 1,380,046109 3,630,178109 Мелассно-дрожжевая среда 4,800,111107 6,050,077108 1,010,042109 Мелассно-минеральная среда 4,940,106107 1,250,029109 4,530,135109. В-409 Д Кукурузно-мелассная среда 5,660,087107 3,670,099109 6,870,291109 Мелассно-дрожжевая среда 5,490,101107 3,490,101108 7,860,216108 Мелассно-минеральная среда 5,720,114107 3,720,114109 7,240,065109 Из приведенных данных следует, что наиболее высокие титры жизнеспособных клеток энтеробактерий получены при культивировании на мелассно-минеральной среде следующего состава,меласса - 3,0 (4)24 - 1,0 24 - 0,5 24 - 0,05. Полученные результаты и тот факт, что данная среда проста в приготовлении, ее компоненты доступны и относительно недороги, определяет ее экономическую эффективность и целесообразность использования для получения биопрепарата. Пример 6. Одно из первых по значимости требований при получении двухкомпонентного препарата - подбор устойчивой при культивировании ассоциации с близким к равновесному соотношением компонентов в целевом продукте. Как видно из фиг. 1, при одновременном внесении в среду культивирования посевного материала энтеробактерий в соотношении 11 между бактериальными компонентами отсутствует антагонизм. При совместном глубинном культивировании в мелассно-минеральной среде ассоциация. В-402-Д. В-409-Д через 48 ч обеспечивает общий титр 5,03 млрд. КОЕ/мл и близкое к равновесному соотношение бактериальных компонентов. Иное соотношение компонентов в посевном материале не обеспечивало равновесного соотношения энтеробактерий в целевом продукте при внесении в среду культивирования посевного материала энтеробактерий в соотношении 0,51 или 10,5 преимущественное развитие получал штамм, внесенный в большем количестве. Пример 7. Оптимизацию основных параметров культивирования консорциума энтеробактерий в ферментере АНКУМ-2 М проводили при трех режимах аэрации (расход воздуха 1,0 0,75 0,5 объема на объем среды в минуту), температуре 28 С. Результаты приведены в табл. 9. Как видно из данных, оптимальные технологические параметры совместного культивирования. В-402-Д. В-409-Д в ферментаторе,обеспечивающие получение препарата с общим титром жизнеспособных клеток энтеробактерий 5,72109 КОЕ/мл и близким к равновесному соотношению бактериальных компонентов, следующие среда - мелассно-минеральная, температура - 28 С, аэрация 0,75-1,0 л воздуха/л среды, время культивирования - 48 ч, количество вносимого посевного материала - 10(соотношение компонентов 11) от объема среды. 10 14450 1 2011.06.30 Таблица 9 Совместное глубинное культивирование. В-402 Д и. В-409 Д в мелассно-минеральной среде на ферментаторе Титр жизнеспособных клеток, КОЕ/мл Время культиви-. В-402 Д. В-409 Д аэрация 0,5 л/мин 8 0 5,830,12110 2,820,123108 3,01108 24 7,230,055108 3,340,076108 3,89109 48 4,100,076109 1,810,031109 2,29109 аэрация 0,75 л/мин 8 0 6,230,21910 3,270,075108 2,96108 24 2,030,081109 9,800,462108 1,05109 48 5,580,083109 2,690,083109 2,89109 аэрация 1,0 л/мин 8 0 5,920,13910 2,830,094108 3,09109 24 1,890,107109 9,200,408108 9,70108 48 5,720,090109 2,720,057109 3,00109 Пример 8. Наработана опытная партия биопрепарата и проведены исследования динамики выживаемости энтеробактерий-продуцентов в течение 6-ти месяцев хранения в холодовом помещении при температуре 8 С (фиг. 2). В течение 30 суток хранения жидкой формы препарата при пониженной температуре титр энтеробактерий в нем практически не изменился. Спустя три месяца общая численность. В-402 Д и. В-409 Д снизилась на 1,5 порядка и составила 1,030,041108 КОЕ/мл. Через полгода хранения титр продуцентов остается на уровне экологически значимой величины(3,730,176107 КОЕ/мл). Контаминирующая микрофлора в препарате, хранившемся при пониженной температуре, не обнаруживалась. Полученные данные свидетельствуют о высоком биотехнологическом потенциале энтеробактерий в плане их выживаемости, что позволяет использовать препарат в жидкой форме по назначению после его достаточно длительного хранения при пониженной температуре. Пример 9. Получение препарата путем иммобилизации на торфяной субстрат проводили в асептических условиях введением культуральной жидкости консорциума энтеробактерий из ферментера через дозатор с полой иглой в пакет с субстратом из расчета 60 г культуральной жидкости на каждые 140 г торфяного субстрата. Прокол в пакете запаивали, либо заклеивали скотчем. Для рационального распределения клеток энтеробактерий в субстрате-носителе содержимое тщательно перемешивали. Вес одной гектарной порции торфяного препарата 200 г. Доращивание энтеробактерий в торфяном препарате проводили при температуре 18-20 С. Время доращивания - 72-96 ч. В 1 г препарата после доращивания содержится более 5 млрд. клеток консорциума энтеробактерий. Пример 10. Данные о динамике численности жизнеспособных клеток энтеробактерий и посторонних микроорганизмов в стерильном и нестерильном торфяном субстрате в процессе хранения представлены в табл. 10. Спустя месяц хранений в 1 г препарата, изготовленного на стерильном торфяном субстрате, титр энтеробактерий выше в сравнении с начальным почти в два раза (5,400,228 КОЕ/г а.с.в), в нестерильном - практически не меняется (2,290,115 млрд. КОЕ/г а.с.в). По мере увеличения срока хранения численность энтеробактерий постепенно снижается. После шести месяцев хранения препарата при пониженной температуре их количество в стерильном торфяном субстрате снижалось на порядок и достигало 2,420,107108 КОЕ/г а.с.в., в нестерильном - почти на 2 порядка (3,740,120107 КОЕ/г а.с.в). Полученные дан 11 14450 1 2011.06.30 ные свидетельствуют, что энтеробактерии лучше сохраняют жизнеспособность на стерильном субстрате. Вместе с тем существенна проявляемая ими конкурентоспособность размножение в нестерильном субстрате, на фоне аборигенной микрофлоры. Таблица 10 Выживаемость энтеробактерий и наличие контаминирующей микрофлоры в торфяной форме биопрепарата при хранении (8 С) Длительность Общий титр жизнеспособных клеток Контаминирующая микрофлора хранения, мес продуцентов, КОЕ/мл КОЕ/мл стерильный торфяной субстрат 0 2,87 0,107109 6,34 0,305102 9 1 0,3 5,40 0,22810 1,66 0,076107 9 7 3 2,1 1,06 0,04510 2,23 0,06210 8 7 6 6,2 2,42 0,10710 1,53 0,07510 нестерильный торфяной субстрат 0 0,4 2,73 0,127109 1,03 0,044107 9 8 1 15,8 2,29 0,11510 3,62 0,09110 8 8 3 29,7 5,47 0,26910 1,61 0,04510 7 7 6 49,0 3,74 0,12010 1,83 0,08610 Пример 11. Показателем эффективности того или иного приема является величина дополнительной урожайности, полученная от его применения. Урожайность ячменя и его структура представлены в табл. 11. Как следует из данных, максимальная прибавка урожая зерна пивоваренного ячменя достигнута при введении в технологию его возделывания биологического препарата, полученного по предлагаемому способу. Максимальные урожайности получены при предпосевной обработке семян ячменя препаратом жидким (53,5 ц/га) и торфяным (54,2 ц/га). Эффективным приемом возделывания культуры была и обработка растений по вегетации в стадии ДК 49. Применение жидкого и торфяного препаратов эквивалентно дополнительному внесению 20 минерального азота на гектар посева пивоваренного ячменя. Таблица 11 Урожай зерна пивоваренного ячменя сорта Бровар в зависимости от минеральных удобрений и биологического препарата Норма Стадия Урожай- Прибавка внесения внесения, ность, к контролю Вариант опыта л/т, кг/т, л/га ДК ц/га ц/гаКонтроль (без внесения мин. уд.) 0 52,2 6090100-Эталон 0 52,5 0,3 0,5 Контроль 150 52,1-0,1 -0,3 Контроль 200 54,1 1,9 3,5 6090100 препарат (твердый субстрат) 1,0 семена 54,2 2,0 3,7 6090100 препарат (жидкая форма) 10 семена 53,5 1,3 2,4 6090100 препарат (жидкая форма) 0,2 ДК 49 53,1 0,9 1,7 6090100 препарат (жидкая форма) семе 100,2 52,6 0,4 0,8 наДК 49 Пример 12. Ключевой показатель качества пивоваренного ячменя - содержание белка в зерне. Данные по содержанию белка, а так же по другим показателям качества полученного зерна, представлены в табл. 12. 12 14450 1 2011.06.30 Таблица 12 Пивоваренные качества зерна ячменя сорта Бровар Норма Содержа- Масса Стадия Вариант опыта внесения ние 1000 внесения, ДК л/т, кг/т, л/га белка,зерен, г Контроль (без внесения мин. уд.) 0 10,5 49,0 6090100- Эталон 0 10,5 48,8 Контроль 150 10,1 49,7 Контроль 200 10,3 50,4 6090100 препарат (твердый субстрат) 1,0 семена 10,5 48,9 6090100 препарат (жидкая форма) 10 семена 10,1 48,9 6090100 препарат (жидкая форма) 0,2 ДК 49 10,5 48,4 6090100 препарат (жидкая форма) 100,2 семенаДК 49 10,7 49,3 Как видно из данных, замена 15-20 технического азота на препарат обеспечивает получение зерна с содержанием белка до 12 , что соответствует его технологическим свойствам по ГОСТ 5060-86 1 содержание белка в нем 10,1-10,5 . Сравнительные характеристики заявляемого консорциума микроорганизмов. В-402 Д и. В-409 Д и биопрепарата для повышения продуктивности пивоваренного ячменя и штамма прототипа представлены в табл. 13 и 14. Приведенные примеры отражают спектр возможностей положительного использования консорциума микроорганизмов и биопрепарата на их основе для повышения продуктивности и качества зерна пивоваренного ячменя. Таблица 13 Спектр хозяйственно-ценных свойств консорциума штаммов . В-402 Д и. В-409 Д. Свойства Количественные характеристики В-402 Д (прототип) Ростстимулирующая Стимулировал рост и развитие Стимулировал рост и активность проростков 5 сортов пивоваренного развитие проростков ячменя в сравнении с контролем зерновых (пшеница,энергия прорастания семян возрос- рожь, ячмень) в средла в среднем на 67,4 , всхожесть - нем на 36 . на 85 , накопление сырой/сухой массы проростков - на 26/34,5 ,длина - на 30 . Продуцирование ИУК,мкг/мл 19,40,05 19,00,06 Нитрогеназная активность в чистой культуре,нМоль 24/фл./сут 4,10,18 2,30,21 в ассоциации с растением,нМоль 24/раст./сут 186,34,23 135,13,50 Фосфатмобилизующая активность, диаметр зон растворения ортофосфатов кальция, мм 19,3-21,2 10,5-12,4 Содержание белка в зерне,10,1-10,5 Анализ представленных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый консорциум энтеробактерий превосходит прототип по ряду показателей 13 14450 1 2011.06.30 по хозяйственно-ценным признакам (ростстимулирующий эффект, азотфиксирующая,фосфатмобилизующая активность и антимикробному действию) позволяет получить жидкий и торфяной препарат комплексного действия для повышения продуктивности и качества зерна пивоваренного ячменя позволяет оптимизировать режим азотного и фосфорного питания, повысить урожайность и при этом сохранить необходимые пивоваренные качества зерна пивоваренного ячменя по содержанию белка для пивоваренной промышленности позволяет уменьшить техногенную нагрузку на экосистему - снизить применение минеральных удобрений и пестицидов в технологии возделывания пивоваренного ячменя Таблица 14 Спектр антибактериальной активности консорциума штаммов . В-402 Д и. В-409 Д Диаметр зон ингибирования роста фитопатогенов, мм Вид фитопатогенных микроорганизмов консорциум энтеробактерий. В-402 Д (прототип)29,31,42 28,31,2128,81,33 28,61,1213,01,47 12,51,5020,91,01 20,00,75. 31,21,55 23,01,0129,71,34 21,02,0129,91,44 24,00,7136,61,78 36,61,23 Препарат на основе консорциума энтеробактерий, является экологически чистым, т.к. микроорганизмы, входящие в него, являются непатогенными для человека, растений, животных, генетически немодифицированными. Источники информации 1. Ячмень пивоваренный. Технические условия. ГОСТ 5060-86. Введ. 18.12.86. - М. Гос. Стандарт Союза ССР Гос. Комитет СССР по стандартам, 1986. - 6 с. 2. Кадыров А.М. Технология возделывания пивоваренного ячменя с высокими технологическими свойствами зерна. Рекомендации по возделыванию пивоваренного ячменя. Минск УП Орех, 2004. - 20 с. . 3. Кожемяков А.П., Белимов А.А. Перспективы использования ассоциаций азотфиксирующих бактерий для инокуляции важнейших с.-х. культур. Экология и биотехнология азотфиксирующих почвенных микроорганизмов тр. ВНИ- ИСХМ Под науч. ред. И.А. Тихоновича. - С.-Петербург, 1991. Т. 61. - С. 7-18. 4. Патент РБ 4632 1, МПК 12 1/20, 2002. 5. А.с. СССР 1723078 1, МПК 05 11/08,12 1/20, 1991. 6. Патент 2224791 1, МПК С 12 1/20,01 63/00, 2004. 7. Патент 11555 2, МПК 12 1/20,05 11/08 (прототип). 8. Патент 2149552 1, МПК 12 1/20,01 63/00,12 39/00,2000. 9. Патент 2314693 2, МПК 01 63/02,12 1/20, 2008. 10. Патент 6524998, МПК 01 043/08, 2003. 11. Патент 6589524, МПК 01 025/00, 2003. 12. Патент 2264999 2, МПК 05 11/08, 2005. 13. Патент 44189 , МПК 05 11/08 А. 14. Биотехнология. - 2001. -2. - С. 57-63. 15. Генетические методы селекции клубеньковых бактерий, 1984. 14 Фиг. 1. Совместное глубинное культивирование. В-402 Д и. В-409 Д в мелассно-минеральной среде на качалке.- соотношение. В-402 Д и. В-409 Д в посевном материале 0,51- соотношение. В-402 Д и. В-409 Д в посевном материале 11- соотношение. В-402 Д и. В-409 Д в посевном материале 10,5(хранение при температуре 8 С).- общий титр жизнеспособных клеток продуцентов в жидкой форме биопрепарата, КОЕ/мл. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 15