Композиция для стимуляции лактации у коров и повышения степени усвояемости кормов

концентрации мочевины 3 М, могут ис пользоваться концентрации 2 М и лаже 1 М, но с меньшей растворимостью при ЭТОМ- СОМЗТОТРППЪЧЗ. 5Величина водородного показателя буферного раствора мочевины 7105.В этих пределах величин водородного показателя извлечение соматотропииав виде осадка из раствора в общем 10 случае составляет по меньшей мере примерно 60, более высокое извлечение(901) может быть обеспечено при рНТемература раствора во время про 15 ведения операции осаждения долна.быть достаточно низкой, чтобы избежать олигомеризации соматотропина,а именно менее 10 И более 5 С.Для получения полипептида, связан- да ного с одновалентным металлом, раствор, подвергнуты депирогенизации и стерилизации, обрабатывают путем диафилътраци (или диализа), чтобы заме 4 нить мочевину раствором бикарбоната 25 металла (например, 25 мМ раствор НаНС 03, рН 9,5) или другой пригодной солью. Многократнъй обмен с помощью раствора бикарбоната металла осуществляют для обеспечения полного обмена 30 мочевины. Получениы раствор далее подвергают обработке с помощью дополнительной диафильтрации сводой для удаления избытка ЫаНС 03 на что указывает начало выпадения в осадок свя 35 ванного с металлом биологически активного соматотропина. Извлечение натрий-соматотропина с помощью процесса лиофилизации приодит к получению порошка, представляющего собой натрие до вую соль соматотропина.для получения полипептида связанногос поливалентнмметаллом, Рас вор после депирогенизацни И СТЕРНЛИ д 5 зации подвергают контактировачрю С солью поливалентвогометалла ТЗКОГО как, например,пк.ПрименениеРдСТВ 0 ра хлоридацшнка коНЦентраЦней 1 Мобес печивает получене в виде осадка соматотропинацннка из раствора мочевины соматотропина имеющего концентрацию 4,5 М мочевины, хотя могут нспользонаться более высокие или более низкие концентрации хлорида цинка. Раствор хлорида Цинка добавляют мед-. ленив, например путем титрования,при одновременном перемешивании раст вора соматотропина.По мере добавления раствора хлорида цинка раствор соматотропина внача ле имеет беловатый цвет, а затем жемчужнобелый после добавления всего стехиометрического количества цинка. Так, например, путем добавления 4 мл раствора хлорида цинка концентрацией 1 М к 400 мл раствора с рн 9,5, содержащего примерно 20 мг соматотропи на на 1 мл и 0,9 М трис(оксиметил) аммнометала в мочевине, имеющего коицентрацию 4,5 М, получают однородную жемчужиобелую суспензию Цинка-соматотропина. Можно добавить дополни тельное количество хлорида цинка(например, до 10 мл раствора хлорида цинка концентрацией 1 М), чтобы обеспечить полное выпадание в осадок.Затем суспензию разбавляют, чтобы уменьшить тенденцию к увеличению размера частиц осадка.Разбавление с помощью примерно 3,5 объемов воды до концентрации мочевины, равной прнмерг но М, предохраняет частицы цинкасоматотропинаотагломерацнн. извлечет ние путем диафильтрации (или многократного центрифугирования и промывания) с целью удаления мочевины,трис(оксиметил)аммнометана и ионов цинка и хлора с последующей лиофили эацией обеспечивает получение порошка, имеющего размер частиц в общем случае меньше 10-20 мкм.Частицы бычьего соматотропина соч держат примерно 0,3 12 цинка (1 д молекулы цинка на 1 молекулу соматотропина). При увеличении скорости добавления цинка увеличивается количество осадка вплоть до 452. Это обусловлено тем, что имеет место дополнительное присоединение цинка к активным кислотным центрам на соматотропине, т.е. на дополнительным остатках аспарагиновой и/или глутами новой кислоты или гистиднновьп остатках, или на карбоксиконцевы группах полипептида.П р и м е р 1. Получение бычьего соматотропина связанного с цинком.Бычий соматотропин с М-концевым метионином СМВ 5) получают по известному Методу Путем лизиса клеток бактерий И последующего вьщеления соматотропина из остатков бактериальных клеток.Бактерии уничтожают путем обработки 5 П 2 ной серной кислотой, что ока зынается достаточны для тогочтобы снизить рНферментацноНного бульона до 1,7.Бульон нейтрализуют добавлением гидроокиси натрия и затем подвергают центрифугированию с получением в результате пасты из клеток, которую затем суспендируют в мочевина, подвергают гомогенизации и охлаждению до примерно дС (эта температура поддерживалась до тек пор,пока не осуществлялся процесс лиофилизаци бычьего соматотропина с Мконцевым метионином, а затем осуществляют центрифугнрование и 3 кратное промывание, а также растворениев растворе гидрохлорида гуанидина концентрацией 7 М. Центрифугирование необходимо, чтобы удалить нерастворимые приеси. Затем проводят фильтра 5ют через колонку, заполненную С 25 Берпаоех, в которой гуанидин заменен на мочевину, опять фильтруют н полученную субстанци далее пропускают через ионообменную колонку типа ВЕ 52. Объем выодящего из колонки потока уменьшают примерно в 30 раз с помощью ультрафильтрации через пустотелые волокна. Концентрированный раствор далее пропускают через хроматографическую колонку, заполненную С 75 5 ерЬаех а затем осуществляют другую стадию уменьшения объема путем пропускания через пустотелые волокна и далее полученную субстанцю подвергают обмену, в соответствии с которым мочевина вначале заменяется на раствор ЫаНС 03 а затем на дистиллированную воду, чтобы обеспечить выпадение в осадок бычьего соматотропина с Ы-концевы метионином. Полученный осадок подвергают лиофилизации с получением в результате белого твердого вещества, слабо растворимого в воде и содержащего полнпептид, представляющий собой бычий соматотропин с Н-концевым метионином. содержащий Ннф-мет-фе(1)-про(2)Д леи(126)фе(190)-СООН аминокислотную последовательность. Такой полипептид - бычий соматотропин с Ы-концевым 50 метионином подвергают раствореиию.в4,5 М растворе мочевины, 0,09 М растворе трис(оксиметил)аминометана при концентрации 21,5 мг указанного полипептида на миллиптр при дС и рн 9,5.554 Полученный раствор полмпептида бычье ГО СОМаТОТрОПННа с ЫКОНЦЕНЫМ МЕТИОЙИ ном подвергают депирогенизации путем смещения с 0,2 г гранул перемешаннойаиионо- и катионообменной смол типа Вйогаа АС-501 Х 8 иа каждый миллилитр стерильного раствора лолидептида. Полученную таким образом смесь перемешвают примерно в течение 10 мин при 4 С, а затем подвергают фильтрации с помощью нейлонового фильтра,имеющего отверстия 1 мм, с цепью Удалениягранул ионообменной смолы,содержащих адсорбированные пирогены. Полученный депирогенированный полипептид -.бьщий соматотропин с Нконцевы метионином (МВЗ) стерилизуют путем пропускания раствора через стерилизованньй радиацей (облучением) гофрированный капсульныи фильтр с отверстиямм диаметром 0,2 мм с целью удаления нестерильных инородным тел,таких как бактерии или загрязнения со стадий предшествующей переработки. Полипептид МВ 8 превращают в цинковую соль полипептида (2 пМш) добав К пением 1 М клорида цинка при одновременном перемешивании дедирогенированного раствора попипептида МВ 8. Выпавший в осадок 2 пНШ 5 содержит примерно 1 цинка. Раствор, содержащий твердый материал 2 пЫШ 5, далее разбавляют стерильной депирогенированной водой до концентрации мочевины в нем 1 М. Полипептид 2 пМВ 5 извлекают центриФУГИРованием с ускорением 10000 3 в течение 30 мин и при этом температура поддерживается равной дС.Указанны полипептид далее подвергают суспендированию в стерильной депирогеннрованной воде при концентрации 50 мг 2 пМШ 5//мл, используя при смешении высокие усилия сдвига. Полипептид 2 пМШ 5 да.лее снова извлекают центрифугировани ем при ускорении 10000 3 в течение 30 мн, затем повторно суспендируют в стерильной депнрогенированной воде при концентраци 50 мг 2 пМ 5/мл с использованием высоки усилий сдвига при смешении. Затем полученную суб-ч станцию подвергают лиофнлизации с получением в результате белого рымлого порошка стерипьного 2 пМВ 5.П р и М е р 2. Альтернативный способ попучения 2 пМВ 5.Депирогенированный н стерилизованны раствор, содержащий 21 мг М 5 на 1 мл в растворе мочевины концентрацией 4,5 М, содержащй 0,05 М трисСоксиметил)амнометан имеющий температуру 10 С н рН 8,8, подвергают ре ШФКУПНШХИ ЧЕРЕЗ ЕМКОСТЬ С ПОМОЩЬЮплунжерного насоса. На лини всоса насоса вводят раствор хлорида цинка концентрацией 1 М до тех пор, пока концентрация хлорида Цнка в раство 5 ре не становится равной 0,01 М, что приводит к выпадению в осадок 2 пМВ 5. Далее добавляют воду для разбавления,чтобы обеспечить концентрацию 10 мгМШ 5 на 1 мл, приводящую к дальнейще 10 ну вьшадению в осадок 2 пМ 5. Полученную таким образом суспензию 2 пМ 5 подвергают циркулированию при 25 С через диафильтрационную мембрану, состоящую из полъщ волокон и которая . 15 имеет отверстия, пропускающимоле.дкулы мол.м. до 100000. Эта операция проводится до концентрации 40 мг ЬШ 5на 1 мл. Далее добавляют воду с целью подогнать скорость фильтрации-через 20 мембрану таким образом, чтобы удалить из суспензии практически все количество цинка, мочевины и трис(оксиметил аминометила. Добавление воды прекрат щают, чтобы. обеспечить концентрацию, 35 примерно равную 80 мг МВ 5/мл. Получент ную таким образом концентрированную суспензию далее подвергают лиофилиза Цнн с получением сухого белого порошка 2 пМ 5, имеющего размер частиц О,5 30 11 мкм.Депирогеннрованный.и стернлизован. ный раствор, содержащий 21,5 мг МШ 5 35 на 1 мл в растворе мочевины концентт рацией 4,5-М, содержащий 0,05 М трис(оксиметил)аминометан, имеющий темературу 4 С и рН 9,5, подвергают дналит ЗУ с целью замены мочевины вначале о на раствор ЫаНСОд, а затем на дистиллированную воду. Водны обмен останавливают в тот момент, когда начинает происходить выпадение в осадок МШ 8. Полученны таким образом раствор да 45 лее подвергаютфильтрации с помощью Фильтра, имеющего размер отверстий-0,2 мкм,для удаления выпавшего в осадок МВ 5 н затем подвергают лиофилиза Ци с получением в результате натрие о вой сол (НаМШ 5).Определенный объем кунжутного мас- д 5 па, сорт РЪБНЕК НЕ, помещают в трехГОРЛУЮ колбУ С круглы основанием.В качестве агента противогидратации добавляют моностеарат алюмния (А 1 М 5)в количестве 52 от общей массы моностеарата алюмния и кунжутного масла. Эту колбу помещают в масляную баню,имеющую температуру 155 С, И содержимое подвергают моностеарата алюминия диспергирования моностеараталюмния так быстро, как только возможно. Процесс перемешмвания продолжают в течение 2 О мни, за это время происходит полное растворение моностеарата алюминия в масле. колбу затем извлекают из масляной бани, выдерживают под вакуумом и-охлаждают до 25 С. После охлаждения полученный раствор превращается в густой гель. Охлаждеиныйгель выгружают в шаровую мельницу,иеющую мешалку, обеспечивающую высокие усилия сдвига в слое, состоящем из шариков из нержавеющей стали, имеющх диаметры 1/8, 3/16 и /4 дюйма(0,32 0,48 и 0,64 см соответствеи но). В рабочем пространстве мельницы создается вакуум, н порошок 2 пМ 5, полученный, как в примере 1, медленно подается в рабочее пространство мельниц с использованием шнекового питателя до тех пор, пока количество 2 пН 5 в композиции не достигнет ДОИ(отношение 2 пМ 5 и моностеарата алюммния равно 13,3). Процесс перемешивания продолается в течение 6 ч, за этот период средний по объему днаметр частиц 2 пМ 5 уменьшают с 20 до5 мкм. Полученную в результате практически безводную гелеобразную масляную суспензию 2 пМ 5 отделяют от шариков из нержавеющей стали путем фильтрации.Практически безводную композицию получают, как в примере 4, путем растворения 52 моностеарата алюминия В кунжутном масле, нагретом до 155 С Это масло затем охлаждают с получением в результате гелеобразного масла. 2 пМ 5 подвергают диспергированию и размолу в масле до тех пор, пока ко личество 2 пМ 5 в композиции не достигнет 32 в непрерывной фазе масла (отношение апъшз и моностеарата алюмния(3,8 смд, заполняют 2,54 г С 35 МЛ) КОМПОЗИЦИИ С образованием ДОЗЫ, СОДЕВ жащей 805 мг 2 пМ 5. Эта композиция ХЗРЗКТЕРНЗУЕТСЯ СПОСОНОСТЬЮ К ШИРИ цеванию, равной 0,36 мл/с. Получают также чистыекомозиции кунжутногомасла с 5 моностеарата алюминия, но без полипептида, изаполняют аналогичные пшрицы 2,4 г этих конлозишдйл. Указанные композиции вводят инъекдней 23 молочным коровам породы Но 1 все 1 п на втором или третьем трехмесячном сроке их второй или последующей лактации. Коровы сгруппировывают в четыре группы, содержащие 5 или 6 жнвотньън. Двум группам коров инъекции вводят внутримышечно (1 М) в область. желудка, ПРИЧЕМ ОДНОЙ ГРУППЕ ВВОДЯТкомпозицию, содержащую ЕпМВЗ, а другой, контрольной группе, - композицию, не содержащую полипептнд. Анапогично двум другим группам животных вводят как композицию, содержащую по 15содержащую полипептид, подкожно в зсугсраскапупярнуто область. Кутаулятгшные значения, полученные методом наименьших, квадратовсредней удойности по молоку (ковариантно рассчитанные через разности входных значении производительности по молоку) ,приведены в табл. 1. Как показано в табл. 1, единичная внутримышечная шш подкожная инъекция предлагаемой кошозиции приводит к . быстрому и продошштепъному еулучшеншо производства молока при высоких значениях статистической значимости. уОбразцы крови подвергают анализу с целью определения бычьего соматотропика, который без ввода объгчно присутствует в штркуляционной системе крутого рогатого скота. Результаты 31184111505, проведенных с помощью радиошчячунологичесшос опытов, представле до ны в табл. 2.П ри м е р 6. Эффективность композиции для увеличенного периода вьщеленив пошшептъща 04135 у цветных.Эти коштоеишги содержат ряд раеш-хчх-гьп материалов. Кошозшши гпмвз готовят, как в примере 5, с использованием комбинаций следтщнэ компонентов бнологическн совместимое масло и масло из семян кунжута или земляного ореха агент протнвогидратадии и моностеарат алюминия при концентра они 3 или 5 от масла и моностеарата шпоъппшзцполгшептид и ЗЦМВЗ ПРИ Кон шхентрашш 20, 30 или 402 от общей ком-д Дпознвии. лМоностеарат шпомнння диспергирутот в масле. Дисперсию после нагреванияохлаждают до 25 С с получением гелеобразного масла. Далее добавляют пМ 5 и полученнуюсмесь подвергаютспергированию в смесителе, обеспечивающем вьшокие усилия сдвига, в результате получают суспензию зпьшэ в гелеобразном масле. Этой суспензией заполняют туберкулновые шприцы, оснащенные гиподермическим иглами 18 калибра.Составы комоэиций приведены в табл. 3. тКомпозиии (табл.3) вводят подкожно в дорсальную (спинную) супраскуляриую область крысам (самам) породы Зргоаце-Ваи 11 у (1 Р 5 П) которые разделяют на 16 групп по 8 шт. в каддой. У крыс подавляют нмунную систему.Образцы крови подвергают анализу с помощью радиоиммунологическик оптов на бычий соматотропин. Данныеприведены в табл. д. Плазменные кон центрашаи представишь для образцов крови, взятых перед инъекцией В ДЕНЬО (в день инъекции). Некоторые измерения точек отсчета для крыс в группах 4-7 являются более высокими по Сравнению с. некоторыми точками отсчета и измерениями въщеленного полипептида-дхтя коров в примере 5. Это обусловлено тем, что имеют место различия в обычных концентрациях сомато- трогшна н вследствие того, что рационммунологические анализы в примере 5 более точные.Средние значения концентрации для контрольных групп 159 и 13 равны в диапазоне 5 - -12 нг/мп на каждый из указанны дней.Ц р и м е р 7. Эффективность композиций, обеспечивают-пс увеличенный,период выделения полипептида (1435), в которых используются. в качестве агентов противогидраташш соли алюминия на основе кислот парного ряда,з частности ъоюнопальш-ттат и менопаурат агцоминня с кух-пкутнъш и аракисовш масламты -Гелеобразные масла, содержащие 32 нонолаурата и монопальмитата алхиминия получают, какв примере 6. 21114788 подвергают суспендированию в гепеобразных маслах при концентрации, равной 302 от массы всей композиции (отношение ИпМВЗ и монолау-рата адпотшння идти нонопальмитата адпамнния равно 14,3). Каждая композиция вводится инъ