N-алкил-2-замещенные аналоги АТФ и способ их получения

(72) Авторы ИНГОЛ Энтони Ховард, КЕЙДЖ Питер Алан, КИНДОН Николас Дэвид(57) 1. -алкил-2-замещенные аналоги АТФ общей формулы 3 где 1 и 2 независимо представляют водород или галоген 3 и 4 независимо представляют фенил, С 1-С 6-алкил, возможно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из 5, С 1-С 6-алкилтио, 67, фенила, СОО 8 или галогена, где 5, 6, 7 и 8 независимо представляют водород или С 1-С 6-алкил Х - кислотный остаток,или их фармацевтически приемлемые соли. 2. Соединение формулыпо п. 1 или его фармацевтически приемлемая соль, где -2. 3. Соединение по п. 1 или 2 или его фармацевтически приемлемая соль, где 4 - С 1-С 6-алкил, возможно замещенный галогеном. 4. Соединение формулыпо любому из пп. 1-3 или его фармацевтически приемлемая соль, где 1 и 2 являются . 5. Соединение формулыпо любому из пп. 1-4 или его фармацевтически приемлемая соль, где 3 - С 1-С 6 алкил, возможно замещенный С 1-С 6 - алкилтиогруппой. 6. Соединение формулыпо п. 1, представляющее собой моноангидрид -этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -этил-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -2-(метилтио)этил-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой или его фармацевтически приемлемая соль. 7. Соединение формулыпо п. 1, представляющее собой моноангидрид -бутил-2-(пропилтио)-5 адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -пропил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой 4635 1 моноангидрид -(1-метилэтил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(2-метоксиэтил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -циклопентил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -фенил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(2,2,2-трифторэтил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(метоксикарбонилметил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(2-метилтиоэтил)-2-пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -2-(,-диметиламино)этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид 2-(циклогексилтио)этил-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(2,2,2-трифторэтил)-2-3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой моноангидрид -(2-метоксиэтил)-2-3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой или его фармацевтически приемлемая соль. 8. Соединение формулыпо любому из пп. 1-7 или его фармацевтически приемлемая соль, ингибирующие агрегацию тромбоцитов. 9. Способ получения соединений формулыпо любому из пп. 1-7 или их фармацевтически приемлемых солей, заключающийся в том, что а) соединение общей формулыили его соль 3 где 3 и 4 имеют указанные в п. 1 значения 1 - уходящая аминогруппа или галоген - или уходящая группа 2, где 2 - галоген, подвергают взаимодействию с соединением общей формулыили его солью где 1 , 2 иимеют указанные в п. 1 значения,и затем, в случае когдаявляется 2, подвергают гидролизу,в) удаляют защитные группы из соответствующего защищенного соединения формулы , в котором защищены одна или несколько функциональных групп, и затем, при необходимости, переводят полученное соединение формулыв соль.(56)92/17488 А 1.90/11080 А. ЛАКИН К.М. Кардиология. - 1988. - Т. . -10. - С. 120-126. Настоящее изобретение относится к новым биологически активным соединениям, которые могут быть использованы в фармакологии, и способу их получения. 2 4635 1 Аденозинтрифосфат (АТФ) оказывает сильное фармакологическое действие на различные ткани. Активность АТФ и других внеклеточных адениновых нуклеотидов таких, как аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинмонофосфат (АМФ), опосредуется 2-пуриноцепторами. Однако действие АТФ в некоторых тканях, например в мочевом пузыре, может быть снижено вследствие быстрого дефосфорилирования до АМФ аденозина под действием эктонуклеотидазы, присутствующей в этих тканях. В последних работах, посвященных исследованиям 2-пуриноцепторов, присутствующих в различных тканях, были использованы в качестве биологических зондов аналоги АТФ, которые являются резистентными к дефосфорилированию. В работеи др.( . . ., 1987, 90, 791-795), проведенной с использованием мочевого пузыря иморской свинки, описывается активность таких соединений, как моноангидрид 2-метилтио 5-адениловой кислоты с метиленбифосфоновой кислотой, моноангидрид 2-метилтио-5-адениловой кислоты с дихлорометиленбифосфоновой кислотой, и моноаонгидрид 2-метилтио-5-адениловой кислоты с дифторометиленбисфосфоновой кислотой. В работеи(. . ., 1989, 97, 631-635) описано использованиемоноангидрида 2-метилтио-5-адениловой кислоты с дифторметиленбисфосфоновой кислотой в исследовании 2-пуриноцепторов в гиппокампе крысы.ив своей работе(. , ,, 1979, .33-43) раскрывают ингибированиеморской свинки соединением моноангидрида 2-хлор-5-адениловой кислоты с метиленбисфосфоновой кислотой. В работеи(. 1991, 10(5), 1019-1028) также сообщается, что моноангидрид 2-метилтио-5-адениловой кислоты с метиленбисфосфоновой кислотой ингибирует АДФиндуцированную агрегацию тромбоцитов. В международной патентной заявке 92/17488 ( ) раскрывается ряд замещенных АТФаналогов и их активность как ингибиторов агрегации тромбоцитов. В соответствии с изобретением получена группа новых -алкил-2-замещенных АТФ-аналогов формулы , обладающих фармакологической активностью. 3 где 1 и 2 независимо представляют собой водород или галоген 3 и 4 независимо представляют собой фенил или 1-6-алкил возможно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из 5,1-6 алкилтио, 6 7, фенила, 8 или галогена, где 5, 6, 7 и 8 независимо представляют собой водород или 1-6-алкил, ипредставляет собой кислотную часть, или их к фармацевтически приемлемые соли. Соединения формулымогут существовать в таутомерной, энантиомерной и диастереомерной формах,которые также входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулыи его солей,заключающемуся в том, что а) соединение формулыили его соль 3 где 3 и 4 определены выше 1 представляет собой уходящую группупредставляет собой, или) удаляют защитную группу из соответствующего защищенного соединения формулы , в котором являются защищенными одна или несколько функциональных групп а затем, если это необходимо, полученное соединение формулыили его соль превращают в фармацевтически приемлемую соль, или наоборот. В стадии, гдеявляется ОН, уходящими группамимогут быть амины, например диалкиламины,либо насыщенные или ненасыщенные циклоамины а предпочтительно, если такими уходящими группами являются морфолинил, имидозолил или триазолил. Указанную реакцию предпочтительно осуществляют в растворителе, предпочтительно в полярном апротонном растворителе, таком, как пиридин, диметилформамид, ацетонитрил, гексаметилфосфоротриамин ,-диметилпропиленмочевина или 1-метил-2 пирролидинон. Эта реакция может быть проведена при температуре от 20 С до 100 С, например при 1030 С. Соединения формулы , в которыхпредставляет собой ОН, либо являются известными, либо они могут быть получены известными методами, например методом, описанным в международной заявке 92/17499 ( ). Например, соединения формулы , в которых 1 является морфолинилом, могут быть получены из соответствующих 5-монофосфатов путем их обработки морфолином в присутствии конденсирующего агента. Такого, как дициклогексилкарбодиимид, предпочтительно в присутствии протонного растворителя или смеси растворителей, такой как смесь т-бутанола и воды. В стадии, когдаявляется уходящей группой 2, уходящие группы 1 и 2 могут представлять собой галоген, например хлор. 1 и 2 могут быть одинаковыми или различными, но предпочтительно одинаковыми. Соединения формулы , в которыхпредставляет собой 2, могут быть получены из соответствующего нуклеозида посредством реакции этого нуклеозида с фосфорилирующим агентом, несущим три уходяшие группы, т.е. 123, а в частности, РОС 3. Полученное соединение формулыне должно быть обязательно выделено например, оно может быть подвергнуто реакциис соединением формулыс последующим гидролизом, например основным гидролизом с использованием 23. Нуклеозиды и нуклеозид-5-монофосфаты, используемые для получения соединений формулы , либо являются известными соединениями, либо они могут быть получены известными методами из известных соединений (см., например,. 2, .. ,1991). Соединения формулылибо являются известными соединениями, либо они могут быть получены известными методами, описанными, например, в Международной патентной заявке 92/17488 ( .). В рассматриваемой реакции может оказаться необходимым, чтобы функциональные группы, например гидрокси- или аминогруппы, присутствующие в исходных соединениях, были защищенными, а поэтому, в стадии могут быть удалены одна или несколько защитных групп. Подходящими защитными группами и методами их удаления являются группы и методы, описанные, например, в. ,., 1991. Гидроксигруппы могут быть, например, защищены арилметильными группами, такими как фениметил, дифенилметил или трифенилметил ацильными группами,такими как ацетил, трихлорацетил или трифторацетил или тетрагидропираниловыми производными. Подходящими аминозащитными группами являются арилметильные группы, такие как бензил, (,)фенилэтил,дифенилметил или трифенилметил и ацильные группы, такие как ацетил, трихлорацетил или трифтороацетил. Подходящими методами разблокирования являются гидрогенолиз, кислотный или основный гидролиз либо фотолиз. Арилметильные группы могут быть, например, удалены путем гидрогенолиза в присутствии металлического катализатора, например палладированного угля. Тетрагидропиранильные группы могут быть отщеплены путем гидролиза в кислотных условиях. Ацильные группы могут быть удалены путем гидролиза с использованием основания, такого как гидроксид натрия или карбонат калия а такая группа как трихлорацетил, может быть удалена путем восстановления, например, с использованием цинковой и уксусной кислоты. Соединения формулыили их соли могут быть выделены из их реакционных смесей с использованием стандартной техники. Описания вышеупомянутых работ вводятся в настоящее описание в качестве ссылок. Соли соединений формулымогут быть получены реакцией свободной кислоты или ее соли, либо свободного основания или его соли, или производного с одним или несколькими эквивалентами соответствующего основания или кислоты. Эта реакция может быть осуществлена в растворителе или среде, в которой данная соль является нерастворимой либо в растворителе, в котором данная соль является растворимой, например, таком как этанол, тетрагидрофуран или диэтиловый эфир, который может быть затем удаленили путем осушки вымораживанием. Данная реакция может также представлять собой метатетический процесс либо она может быть осуществима на ионообменной смоле. 4 4635 1 Фармацевтически приемлемыми солями соединений формулыявляются соли щелочных металлов, например соли натрия и калия соли щелочноземельных металлов, например, соли кальция и магния соли элементов Группы , например алюминиевые и аммониевые соли. Подходящими солями органических оснований являются соли, образованные с гидроксиламином низшими алкилами, например метиламином или этиламином замещенными низшими алкиламинами, например гидроксизамещенными алкиламинами либо с моноциклическими азотными гетероциклическими соединениями, например пиперидином или морфолином а также соли, образованные аминокислотами, например, такими как аргинин, лизин и т.п. или их алкильными производными или аминосахарами, например, такими как -метилглюкамин или глюкозамин. При этом предпочтительными являются нетоксичные физиологически приемлемые соли, хотя в некоторых случаях, например, для выделения или очистки продукта, могут быть использованы и другие соли. Соединения формулымогут обладать таутомерией, например иминенаминовой таутомерией в 6-положении аденина. Указанные соединения могут также содержать один или несколько ассиметрических атомов углерода. А потому, они могут существовать в виде оптических изомеров и/или диастереоизомеров. Диастереоизомеры могут быть разделены с использованием стандартной техники, например хроматографии или фракционной кристаллизации. Различные оптические изомеры могут быть выделены с помощью стандартной методики, обычно используемой для разделения рацемических или других смесей данных соединений, например,такой как фракционная кристаллизация или ВЭЖХ. Альтернативно, нужные оптические изомеры могут быть получены с помощью реакций соответствующих оптически активных исходных материалов в условиях, не благоприятствующих рацемизации. Алкильными группами, представленными 3-8, могут быть прямые, разветвленные или циклические,насыщенные или ненасыщенные алкильные группы. Галогенами, представленными 1 и 2, являются , , , или . При этом, предпочтительно, чтобы 1 и 2 были одинаковыми. Особенно предпочтительными являются соединения, в которых 1 и 2 представляет собой . Предпочтительными являются соединения, в которых 3 и 4 представляют собой 1-6 -алкил, возможно замещенный одним или несколькими заместителями, выбранными из 5, 1-6-алкилтио, 67, фенила 8 и галогена. Галогены, которые представлены 3 и 4 и которые могут быть замещены, являются ,, а предпочтительно . Особенно предпочтительными являются соединения, в которых 3 представляет собой 1-6 -алкил, возможно замещенный 1-6-алкиотиогруппой. Примерами конкретных алкильных групп, представленных 3 являются пропил, бутил, а особенно этил. Предпочтительными замещенными алкильными группами, представленными 3, является 2-(метилтио)этил. Особенно предпочтительными являются соединения, в которых 4 представляет собой 1-6-алкил, возможно замещенный одним или несколькими, например тремя, атомами галогена. Предпочтительными 4 группами являются пропил и 3,3,3-трифторпропил. Кислотными группами, представленными , являются кислоты Бренстеда-Лоури, т.е. группы, действующие как доноры протона. Указанные кислотные группы могут быть одноосновными или многоосновными. В качестве конкретных примеров таких кислотных групп могут служить - 2, -3 и -2. Предпочтительными соединениями формулы , в которыхпредставляет собой - 2. Поскольку соединения формулыобладают фармакологической активностью, они могут быть использованы для лечения млекопитающих. В частности, они обладают активностью, способствующей предупреждению агрегации тромбоцитов. Эффективность соединений формулыкак ингибиторов агрегации тромбоцитов может быть оценена исходя из их способности действовать как антагонисты по отношению к Р 2 Т-рецептору , см. Пример . Указанные соединения могут быть использованы в любых условиях, где имеет место агрегация тромбоцитов. Таким образом, эти соединения обладают антитромботическим действием, и могут быть использованы для лечения или профилактики неустойчивой стенокардии, тромбоэмболического шока и заболеваний периферического кровообращения. Кроме того, указанные соединения могут быть использованы для лечения и профилактики остаточных явлений тромботических осложнений, возникающих в результате пластических операций на сосудах, тромболиза, эндартерэктомии, операций по пересадке на сердце и сосудах, гемодиализа и искусственного кровообращения. Другими показаниями к применению соединений настоящего изобретения является лечение или профилактика диссеминированного внутрисосудистого свертывания,тромбоза глубоких вен, преэклампсии/эклампсии, повреждения тканей после хирургических операций или травм, васкулитов, артериитов, тромбоцитемии, ишемии и мигрени. Соединения формулымогут быть использованы в виде фармацевтических средств. Кроме того, соединения формулыили их фармацевтически приемлемые соли могут использоваться для изготовления фармацевтических композиций, предназначенных для лечения состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов. Дозы вводимых соединений могут широко варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как структура конкретного соединения формулы , способ введения, физическое состояние 5 4635 1 пациента и тяжесть заболевания. Однако, в основном, дневная доза для человека составляет от 0,1 мг до 1000 мг, и может быть введена в виде разделенных доз до 6 раз в день. Если данное соединение вводится путем вливания, то типичная доза для человека составляет, например, 0,5 мкг/кг/мин. Соединения настоящего изобретения вводятся , в основном, в виде фармацевтической композиции. Так, например, фармацевтическая композиция может предпочтительно включать в себя менее чем 80 мас. , а более предпочтительно менее чем 50 мас. , например от 0,1 до 20 мас.соединения формулыили его фармацевтически приемлемой соли, определенных выше, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Ниже приводятся примеры фармацевтических препаратов, которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения, а также подходящих для этой цели разбавителей или носителей для внутривенных инъекций или вливаний - очищенная вода или физиологический раствор для ингаляций - необработанная лактоза для таблеток, капсул и драже - микрокристаллическая целлюлоза фосфат кальция диатомовая земля сахар, такой как лактоза, декстроза или маннит тальк стериновая кислота крахмал бикарбонат натрия и/или желатин для суппозиториев - натуральные или отвержденные масла или воски. Если данное соединение предназначено для использования в водном растворе, например, для вливаний,то эта композиция может включать в себя и другие добавки. Такими добавками могут быть, например, хелатообразующие агенты или секвестранты, антиоксиданты добавки, корректирующие тоничность модифицирующие агенты и буферные добавки. Если необходимо, то растворы, содержащие соединение формулы , могут быть подвергнуты выпариванию,например, путем осушки вымораживанием или осушки распылением, с получением твердой композиции, которая может быть затем переведена в другую форму непосредственно перед использованием. Если данная композиция не является раствором, то предпочтительно, чтобы она была изготовлена в форме, имеющей средний диаметр от 0,01 до 10 мкм. Указанные композиции могут также содержать соответствующие консерванты, стабилизирующие и смачивающие агенты, солюбилизаторы, например, водорастворимый целлюлозный полимер,такой как гидроксипропилметилцеллюлоза, или водорастворимый гликоль, как пропиленгликоль, подслащивающие добавки, красители и ароматизирующие добавки. Если необходимо, то композиции могут быть изготовлены в виде препаратов с пролонгированным высвобождением. Для лечения заболеваний, связанных с агрегацией тромбоцитов, пациенту, страдающему указанным заболеванием необходимо ввести терапевтически эффективное количество соединения формулы . Преимущество соединений настоящего изобретения заключается в том, что они продуцируют гораздо меньшее количество побочных эффектов. Например, они обладают меньшей способностью к индуцированию гипотермии, как было установлено с помощью методики, описанной в Примере , и, кроме того, они обладают большей продолжительностью действия, являются менее токсичными, более эффективными, более стабильными, более легко абсорбируются, более легко выводятся из организма, обнаруживают более широкий спектр активности, или имеют другие преимущества по сравнению с известными соединениями. Ниже приводятся примеры, иллюстрирующие, но не ограничивающие изобретение. Пример 1. Моноангидрид -этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой,тетранатриевая соль. а). -Этил-2-(пропилтио)аденозин. 9-(2,3,5-Три-О-ацетилрибофуранозил)-6-хлор-2-)-(пропилтио)пурин (1,3 г) и этиламин (1,6 мл) в диоксане (30 мл) и воде (30 мл) нагревали в герметично закрытом автоклаве в течение 20 ч при температуре 110 С. После охлаждения до комнатной температуры и выпаривания получали остаток, который перекристаллизовывали из этилацетата. В результате очистки с помощью хроматографии на двуокиси кремния (элюентметанол/ацетат, 115), было получено целевое соединение, а именно, -этил-2-(пропилтио)аденозин(0,46 г.).370 (МН, 100 ), 238 (30 ). б). Моноаммониевая соль -этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты. К перемешанному раствору продукта стадии а) (0,4 г) в триэтилфосфате (12 мл) при 0 С добавляли 0,66 г оксихлорида фосфора. Через 4,5 ч реакционную смесь выливали в смесь льда/воды (100 г), содержащую бикарбонат натрия (1,45 г). Через 45 мин раствор промывали эфиром (2100 мл) и загружали на колонку 508 ( форма). Эту колонку промывали водой до тех пор, покаэлюата не становился равным 6, а затем элюировали 2 гидроксидом аммония. После лиофилизации получали целевое соединение, а именно, моноаммониевую соль -этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты (0,32 г). 31 ЯМР (2) 2,03 (с). с). Моноангидрид -этил-2-(пропилтил)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тетранатриевая соль. 4635 1 Целевой продукт стадии(0,38 г) и трибутиламин (0,15 г) объединяли в небольшом объеме пиридина, и полученный раствор выпаривали досуха. Затем этот раствор осушали путем азеотропной перегонки с пиридином (315 мл ), а после этого с безводным ,-диметилформамидом (ДМФ) (215 мл ), и образовавшийся остаток растворяли в 10 мл безводного ДМФ. После добавления карбонилдиимидазола (0,66 г), реакционную смесь оставляли на 4 часа при комнатной температуре, а затем добавляли метанол (0,209 г). Через 30 мин добавляли 2,09 г моно(трибутиламмониевой) соли дихлорметиленбисфосфоновой кислоты в безводном ДМФ (30 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. После фильтрования и выпаривания получали остаток, который очищали с помощью хроматографии (-Сефадекс,элюент ОМ-0,6 М бикарбонат триэтиламмония). В результате лиофилизации получали триэтиламмониевую соль, которую превращали в натриевую соль путем растворения в метаноле (2 мл) и добавления раствора йодида натрия (1 М суспензия в ацетоне (30 мл. Осадок собирали путем центрифугирования, промывали вышеуказанной суспензией в ацетоне (440 мл), и снова центрифугировали. Образовавшееся твердое вещество растворяли в воде и лиофилизовали, в результате чего получали целевую соль в виде бесцветного порошка (0,25 г). 31 Р-ЯМР (2) 9,00 (д.18,6 Гц), 1,18 (дд,18, 6 Гц,30,4 Гц), - 9,35 (д,30,4 Гц). Пример 2. Моноангидрид -бутил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой,тетранатриевая соль.). Моноангидрид -бутил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тетранатриевая соль. К раствору продукта стадии а) (1,8 г) в триэтилфосфате (50 мл), охлаждая льдом, по капле добавляли оксихлорид фосфора (1,39 г). Полученный раствор перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. К перемешанной суспензии моно(трибутиламмониевой) соли дихлорметиленбисфосфоновой кислоты(5,76 г) в триэтилфосфате (60 мл) добавляли трибутиламин (2,16 мл). После перемешивания в течение часа при комнатной температуре, полученный раствор в течение 15 минут добавляли к раствору, описанному выше. Затем полученную смесь перемешивали в течение 4 часов, после чего реакционную смесь выливали в 5 водный раствор бикарбоната натрия (113 мл), и перемешивали в течение 18 часов. Полученный раствор промывали эфиром (450 мл), а затем осушали вымораживанием. В результате очистки (обращеннофозовые 18-колонки с двуокисью кремния элюент 4 солевой раствор, а затем вода) получали целевую соль в виде бесцветного твердого вещества (0,69 г). 31 ЯМР (2) 9,70 (д,18,4 Гц), 3,4 (дд,18,4 Гц,30, 5 Гц),-9,19 (д,30,5 Гц). Пример 3. В соответствии со способом, описанным в примере 2, были получены следующие соединения). Моноангидрид -(1-метилэтил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, диаммониевая соль.-(1 -Метилэтил)-2-(пропилтио)аденозин.384 (МН, 100 ), 252.Моноангидрид -(1-метилэтил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой , диаммониевая соль. В результате очистки неочищенного продукта с помощью хроматографии (-Сефадекс элюент 0 0,6 раствор бикарбоната аммония) получали целевую соль. 31 Р-ЯМР(2)8,71 (д,18,6 Гц), 0,38 (дд,19,1 Гц,28,7 Гц), -9,49 (д,29,0 Гц).). Моноангидрид -(метоксикарбонилметил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль-(Метоксикарбонилметил)-2-(пропилтио)аденозин. Анализ для 162356 Вычислено С 46,485,6116,947,76 . Найдено С 46,445,4316,807,67 .Моноангидрид -(метоксикарбонилметил)-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии (-Сефадекс элюент- 0,6 раствор бикарбоната аммония), и получали целевую соль. 31 Р-ЯМР (2 О) 9,05 (д,18,7 Гц), 1,44 (дд,18,8 Гц,29,3 Гц), -9,40 (д,29,5 Гц).). Моноангидрид -2-(метилтио)этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль-2-(Метилтио)этил-2-(пропилтио)аденозин 416 (, 100 ).Моноангидрид -2-(метилтио)этил-2-(пропилтио)-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль. После очистки выделенного сырого продукта с помощью хроматографии -Сефадекс элюент 00,1 раствор бикарбоната аммония) получали целевую соль. 31 Р-ЯМР (2 О) 8,68 (д,18,6 Гц), 0,33 (дд,18,9 Гц,29,0 Гц), -9,53 (д,29,0 Гц).(200 мл) добавляли дициклогексилдисульфид (51,5 г) и изоамилнитрит (16,96 г). Полученный раствор дегазировали азотом, а затем нагревали при температуре 60 С в течение 16 ч. После концентрирования раствора, остаток очищали (двуокись кремния элюент этилацетат/петролейный эфир, 11), и получали целевое соединение, а именно, 9-(2,3,5-Три-О-ацетилрибофуранозил)-6-хлор-2(циклогексилтио)пурин (3,88 г) в виде оранжевой смолы.528, 526 , 43 (100 ).) 2-(Циклогексилтио)этиладенозин. С использованием продукта стадии (а) было получено целевое соединение, а именно, 2-(циклогексилтио)-этиладенозин, в соответствии с методикой, описанной в примере 2 (1 а).410 (МН,100 ). 4635 1 Целевое соединение было получено способом, описанным в примере 2), за исключением того, что использовали продукт стадии ). 31 Р-ЯМР(2 О) 9,85 (д,18,5 Гц), 3,85 (дд,18,5 Гц,30,4 Гц), -9,07 (д,30, 4 Гц). Пример 5. Моноангидрид -этил-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тринатриевая соль. а) 2-(3,3,3-Трифторпропил)тиоаденозин. Суспензию, состоящую из гидрида натрия (60 , 1,453 г) и ааденозин-2-тиомоногидрата (5,35 г) в ДМФ(80 мл), перемешивали в течение часа при комнатной температуре, а затем добавляли 3-хлор-1,1,1 трифторпропан (6 мл). После перемешивания в течение 5 дней раствор концентрировали, а образовавшийся остаток распределяли между этилацетатом (250 мл) и водой (150 мл). Органическую фазу осушали, и затем концентрировали. В результате очистки (2 элюент дихлорметан/метанол, 91) получали целевое соединение, а именно, 2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин в виде бесцветного твердого вещества (5,55 г).396 (МН,100 ).) -Ацетил-2-(3.3,3-трифторпропил)тиоаденозин-2, 3, 5-триацетат. Полученный продукт стадии (а) (5,28 г) и безводный ацетат натрия (0,723 г) в уксусном ангидриде (42 мл) перемешивали в течение 6,5 часа при температуре 80 . Этот раствор разводили водой (100 мл), перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, а затем экстрагировали дихлорметаном(4200 мл). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (200 мл), а затем выпаривали, и образовавшийся остаток хроматографировали на двуокиси кремния (элюент диэтиловый эфир метанол, 973), в результате чего получали целевое соединение)Ацетил-2-(3,3,3 трифторпропил)тиоаденозин-2, 3, 5-триацетат) в виде бесцветной пены (5,35 г)564 (МН), 139) -Ацетилэтил-2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин-2, 3, 5-триацетат. Полученный продукт стадии(5,12 г) в ДМФ (100 мл) в течение 3 часов добавляли к суспензии гидрида натрия (60 , 0,0443 г) в ДМФ (100 мл), содержащей этилиодид (2,2 мл). После перемешивания в течение 2 дней раствор выпаривали, а остаток растворяли в этилацетате (300 мл) и промывали водой (3100 мл). Органическую фазу концентрировали, а затем остаток очищали (двуокись кремния элюент этилацетат.циклогексан, 11) и получали целевое соединение Ацетилэтил-2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин 2, 3, 5-триацетат в виде желтой смолы (4,54 г).592 (МН), 139 (100 ).) -Этил-2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин. Полученный продукт стадии (с) (4,54 г) в растворе гидроксида натрия (0,1 в метаноле, 155 мл) нагревали с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 0,89 мл ледяной уксусной кислоты, и полученный раствор концентрировали. В результате очистки (двуокись кремния элюент дихлорметан/метанол, 955) получали целевое соединение Этил-2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин в виде бесцветного твердого вещества (2,73 г).424 (МН, 100 ).) Моноангидрид -этил-2-2-(3,3,3-трифторпропил)тио 5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тринатриевая соль. Целевую соль получали способом, описанным в примере 2, используя продукт стадии . 31 Р-ЯМР (2 О) 8,89 (д,18,0 Гц), 2,34 (дд,18,0 Гц,30,0 Гц), -9,90 (д,30,0 Гц). Пример 6. Нижеследующие соединения были получены способом, описанным в примере 2 а) Моноангидрид -(2,2,2-трифторэтил)-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль. 4635 1 Найдено С 40,704,8214,7913,60.Моноангидрид -2-(метилтио)этил)-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, триаммониевая соль. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии (-Сефадексэлюент 0,-0,6 раствор бикарбоната аммония), и получали целевую соль. 31 Р-ЯМР (2 О) 8,77 (д,18,7 Гц), 0,38 (дд,18,9 Гц,27,4 Гц), -9,43 (д,28, 8 Гц). Пример 7. Моноангидрид -(2-метоксиэтил)-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тетранатриевая соль. а) -(2-метоксиэтил)-2-(3,3,3-трифторпропил)тиоаденозин. Раствор, содержащий целевое соединение примера (5) (4,8 г), 2-бромэтилметиловый эфир (1,2 мл) и карбонат калия (1,77 г) в сухом ДМФ (190 мл) , перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. После добавления 2-бромэтилметилового эфира (1,2 мл) и карбоната калия (1,77 г) полученную смесь перемешивали в течение 24 ч при температуре 40 С. Реакционную смесь фильтровали, после чего фильтрат концентрировали с получением маслообразного вещества, которое распределяли между этилацетатом (200 мл) и водой (200 мл). Органическую фазу осушали, а затем концентрировали. Полученную смолу растворяли в 0,1 растворе метоксида натрия в метаноле (180 мл), после чего нагревали с обратным холодильником в течение 45 мин. Эту смесь нейтрализовали с использованием уксусной кислоты и концентрировали, а остаток очищали (2, элюентдихлорметан/метанол, 928), и получали целевое соединение (2-метоксиэтил)-2(3,3,3-трифторпропил)тио аденозин в виде бесцветного твердого вещества (3,41 г).454 (МН), 100 ).) Моноангидрид -(2-метоксиэтил)-2-(3,3,3-трифторпропил)тио-5-адениловой кислоты с дихлорметиленбисфосфоновой кислотой, тетранатриевая соль. Целевую соль получали способом, описанным в примере 2, используя соединение стадии (а). 31 Р-ЯМР (2 О) 9,88 (д,19,0 Гц), 3,80 (дд,19,0 Гц,31,0 Гц), -9,12 (д,31,0 Гц). Пример . Количественная оценка агонистической/антагонистической активности по отношению к Р 2 - рецептору с использованием промытых тромбоцитов человека. Венозную кровь человека (100 мл) разделяли на три равные части и помещали в 3 пробирки, каждая из которых содержала 3,2 тринатрийцитрата (4 мл) в качестве антикоагулянта. Затем эти пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 240 , в результате чего получали обогащенную тромбоцитами плазму, к которой добавляли 300 нг.мл-1 простациклина (2 ,3 мкл, мл-1 с 1/10-разведением физиологическом растворе, полученным от маточного раствора 1 мг.мл-1 в этаноле) для стабилизации тромбоцитов в процессе промывки -плазму, не содержащую эритроцитов получали путем центрифугирования при 125 в течение 10 мин, с последующим центрифугированием в течение 15 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок тромбоцитов ресуспендировали в модифицированном, не содержащем кальция растворе Тироде (10 мл, состав 137 мМ (8 г/л)11,9 мМ (1 г/л) 3 0,38 мМ (0,06 г/л)242,86 мМ (1 мл 20 раст./л)1,05 мМ (1 мл 10 раст./л)2 5,55 мМ (1 г/л)декстрозы, который насыщали газом 952/52, и поддерживали при 37 С. После добавления еще 300 нг/мл 2 , суспензию объединяли и центрифугировали при 640 в течение 15 минут. Затем супернатант отбрасывали, и тромбоциты ресуспендировали в 10 млс последующим добавлениемдо конечной концентрации тромбоцитов 210 -5 г/мкл. Полученную суспензию хранили в 60-мл шприце при 3 С, с выпущенным воздухом. Восстановление нормальной функции тромбоцитов после их 2-ингибирования, в целях исследования агрегации тромбоцитов, осуществляли не ранее, чем через 2 ч после последнего ресуспендирования. Во всех иссследованиях 430 мкл-аликвоты суспензии тромбоцитов добавляли в кремниевые кюветы для агрегации, содержащие 2 - раствор (10 мкл 45 мМ раствора, конечная концентрация 1 мМ), и размешивали при 900 об/мин в агрегометре РАР 4 . Затем добавляли фибриноген человека(,4883) и 8 сульфофенилтеофиллин (8-, для блокирования любой 1 -агонистической активности соединений), до конечной концентрации 0,2 мг/мл (10 мкл 10 мг/мл раствора свертываемого белка в физиологическом растворе) и 310-4(10 мкл 5,6 мг/мл раствора в 6 глюкозе) соответственно. После этого начинали наблюдение за агрегацией. Протокол. а) Выбор субмаксимальной концентрации АДФ. Концентрацию АДФ, продуцирующую непосредственно субмаксимальный ответ, выбирали путем построения кривой концентрация/ответ в диапазоне 10-300 мкМ. Для этого соответствующий раствор АДФ добавляли в кювету в объеме 10 мкл через 20 минут после начала наблюдения за агрегацией. Ответную реакцию агрегации оценивали, исходя из максимальной скорости изменения прозрачности, измеряемой с помощью счетчика со скошенным слоем. Субмаксимальную концентрацию АДФ, выбранную на этой стадии 4635 1 протокола, использовали для последующей оценки антагонистической активности соединения. Все измерения, проводимые для тромбоцитов от каждого донора, осуществляли дважды.) Оценка агонистической/антагонистической активности. Через 5 мин после начала наблюдения за агрегацией, соответствующий раствор испытуемого соединения или физиологический раствор добавляли в кювету для агрегации в объеме 30 мкл до получения конечной концентрации 0,10 мкМ или 1000 мкМ. Агрегация на этой стадии указывала на агонистическую активность,и если она имела место, то ее оценку проводили путем сравнения с контрольными АДФ-ответами, полученными в стадии (а). Если агрегация не наблюдалась, то через 15 мин после испытуемого соединения добавляли предварительно выбранную субмаксимальную концентрацию АДФ в объеме 10 мкл. Антагонистическую активность оценивали какингибирования контрольного ВДФ-ответа, в результате чего получали приблизительные значения 50. Соединения, которые полностью ингибировали АДФ-ответ при начальных концентрациях,испытывали снова, но уже при более низком лиапазоне концентраций. Соединения с 5010-8 также подвергали повторному испытанию в отсутствие 8- для подтверждения отсутствия какой-либо агонистической активности по отношению к 1 ,а также с 2-минутным (вместо 15-минутного) инкубированием для того,чтобы проверить, зависит ли ингибирование от времени. Результаты. Характерные результаты, полученные для соединений формулы , представлены в таблице как отрицательные логарифмы антагонистической активности (50). Пример 1 5 6 а Пример . Измерение гипотермической активности с использованием восприимчивых мышей. Для эксперимента использовали мышей /-1 (25-45 г). Этих мышей взвешивали и измеряли температуру ректально с использованием терморезисторного зонда. Затем каждое животное помещали в камеру, имеющую форму усеченного конуса, и хвостовую вену канюлировали с использованием иглы для подкожных инъекций (27 ) соединенной с полиэтиленовой канюлей и закрепленной клейкой лентой в нужном положении. Животных обрабатывали дозой испытуемого соединения, вводимой в виде 10 минутного внутривенного вливания со скоростью 0,5 мл/кг/мин. Ректальные измерения температуры проводили через 1/3 1 1,5 2 3 4 6 и 24 часа после завершения вливания. Затем строили график зависимости среднего максимального снижения ректальной температуры от дозы вводимого соединения, и определяли дозу, требуемую для понижения температуры на 5 С. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 11