Способ получения препарата и препарат для профилактики или лечения мастита у коров

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА И ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ МАСТИТА У КОРОВ(71) Заявители Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Научнопроизводственное республиканское дочернее унитарное предприятие Институт мясо-молочной промышленности Республиканского унитарного предприятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию(72) Авторы Сафроненко Людмила Владимировна Дудко Наталия Владимировна Кравченко Надежда Сергеевна Дымар Татьяна Иосифовна Бородич Людмила Марьяновна(73) Патентообладатели Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Научно-производственное республиканское дочернее унитарное предприятие Институт мясо-молочной промышленности Республиканского унитарного предприятия Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по продовольствию(56)2102075 1, 1998. БОГУШ А.А. и др. Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины, 2009. - Т. 45. Вып. 2. - Ч. 1. - С. 153-154. БОРОДИЧ Л.М. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наук, 2008,3, с. 9299.2084233 1, 1997.4591499, 1986.3984575, 1976. БОРОДИЧ Л.М. Ветеринарная наука производству, 2007. - Вып. 39. - С. 63-70.1813445 1, 1993.288454 6, 2001.2339388 2, 2008.(57) 1. Способ получения препарата для профилактики или лечения мастита у коров, заключающийся в том, что параллельно получают посевной материал штаммовпродуцентов лактобацилл- 352 - Д и- 1190 - Д путем внесения восстановленных культур штаммов-продуцентов в питательную среду, содержащую 20,0 г панкреатического гидролизата казеина, 5,0 г дрожжевого экстракта, 5,0 г пептона, 2,0 г хлорида натрия, 0,1 г -цистеина, 1,0 мл твина,0,15 г агара, 30,0 г глюкозы и воду дистиллированную до 1,0 л, и их культивирования в течение 16-20 часов, при этом восстановленные культуры штаммов-продуцентов вносят в количестве 1-5 от объема питательной среды, культивирование штамма- 352 - Д осуществляют при температуре 36-38 С, а штамма 14987 1 2011.10.30- 1190 - Д - при температуре 32-34 С, полученный посевной материал по отдельности вносят в количестве 7-10 от общего объема получаемого препарата в накопительную среду, содержащую молочную сыворотку и 40 -ный раствор глюкозы в количестве 5 , и осуществляют параллельное накопление бактериальных масс в течение 16-20 часов при температуре 36-38 С для штамма- 352 - Д и температуре 32-34 С для штамма- 1190 - Д, полученные бактериальные массы охлаждают до температуры 8-12 С и смешивают в соотношении 11, при этом общее количество лактобацилл в полученном препарате составляет не менее 107 КОЕ/см 3, доводят значениедо 6,0-6,5 и охлаждают до температуры 2-6 С. 2. Препарат для профилактики или лечения мастита у коров, полученный способом по п. 1. Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано для профилактики и лечения коров,больных маститом. Известен способ получения противомаститного пробиотического препарата, включающий смешивание компонентов, а в качестве компонентов используют смесь лиофилизата термофильного стрептококка штамма 2 КС, обезжиренное молоко с 6,2-6,5,содержащее 1 глюкозы, и воды при следующем соотношении компонентов, мас.лиофилизат термофильного стрептококка 2 КС, содержащего 108 микробных клеток в 100-130 мг 0,1-0,2 обезжиренное молоко с 6,2-6,5, содержащее 1 сахарозы 48-50 дистиллированная вода остальное. Полученную смесь инкубируют при 37-42 С в течение 18-24 часов 1. Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что культура, используемая в способе, сохраняет свою жизнеспособность в обезжиренном молоке в течение только 14 суток. Известен способ получения бактериального препарата, включающий культивирование штаммов-продуцентов лактобацилл на искусственной питательной среде, причем в качестве штаммов-продуцентов лактобацилл используют штаммы-продуценты(Киров-1) и(Киров-4), а в качестве питательной среды,являющейся частью готового препарата, используют мясопептонный печеночный бульон с добавлением 12 глюкозы, 0,12 хлористого натрия, причем культивирование штаммов осуществляют при температуре 37 С и 6-7 в течение 48 часов 2. Недостатком способа является совместное культивирование двух штаммовпродуцентов, так как происходит их спонтанный рост, и преимущество в наращивании биомассы бывает за теми видами, у которых большая скорость роста, что приводит к потере контроля над концентрацией отдельных культур микроорганизмов и их процентным соотношением, что существенно влияет на контролируемые качественные показатели пробиотического препарата, т.е. концентрацию микроорганизмов в препарате. Известные способы получения заявляемого препарата не позволяют его получить ввиду того, что в известных способах проводилось совместное культивирование микроорганизмов в питательной среде, что способствовало спонтанному росту и препятствовало контролю над концентрацией отдельных культур микроорганизмов и их процентным соотношением в препарате. Так, в настоящее время в ветеринарной практике для лечения мастита у коров применяются в основном лечебные препараты, содержащие антибиотики. Антибиотикотерапия при мастите у коров создает условия для возникновения резистентных штаммов патоген 2 14987 1 2011.10.30 ных микроорганизмов в вымени, которые опасны в эпидемиологическом плане, кроме этого, антибиотики, выделяясь с молоком, снижают его санитарные и технологические свойства. Поэтому актуальной является разработка препаратов, позволяющих получать экологически чистую продукцию, не содержащую антибиотики, т.е. пробиотического препарата. В Республике Беларусь не выпускается собственный пробиотический препарат для лечения и профилактики мастита у коров. Известен препарат для профилактики и лечения мастита крупного рогатого скота, содержащий протеолитический фермент, причем в качестве протеолитического фермента он содержит лизоамидазу и дополнительно одно- и двузамещенный фосфорнокислый натрий 3. Однако препарат является активным только в случае мастита стафилококковой и стрептококковой этиологии. Известен антимаститный препарат, включающий водный раствор лиофилизата термофильного стрептококка штамма 2 КС, а в качестве накопительной среды содержит стерильное обезжиренное молоко с 6,2-6,5, содержащее 1,0 сахарозы 4. Однако срок хранения данного препарата ограничен 14 сутками, так как культура термофильного стрептококка сохраняет свои культуральные способности в течение этого времени, что значительно усложняет использование препарата в ветеринарной практике. Известен также препарат для профилактики и лечения мастита у коров, содержащий 15-17,5 млрд. лактобацилл в дозе 5. Однако препарат выпускается в лиофилизированном виде, и перед применением для увеличения объема требуется разбавление равным количеством стерильного 0,9 -ного раствора натрия хлорида, что трудоемко. Известен препарат, содержащий два штамма-продуцента лактобацилл(Киров-1) и(Киров-4), а в качестве питательной среды,являющейся частью готового препарата, используют мясопептонный печеночный бульон с добавлением 12 глюкозы, 0,12 хлористого натрия 6. Этот препарат выпускается в лиофилизированном виде, что существенно усложняет процесс предварительной подготовки к лечебно-профилактическим мероприятиям. Задачей предлагаемого изобретения является создание экологически чистого пробиотического препарата для профилактики и лечения мастита у коров, обладающего широким спектром действия в отношении возбудителей мастита у коров, и разработка способа получения препарата на основе отечественных штаммов. Поставленная задача достигается тем, что способ получения препарата для профилактики или лечения мастита у коров заключается в том, что параллельно получают посевной материал штаммов-продуцентов лактобацилл- 352 - Д и- 1190 - Д путем внесения восстановленных культур штаммов-продуцентов в питательную среду, содержащую 20,0 г панкреатического гидролизата казеина, 5,0 г дрожжевого экстракта, 5,0 г пептона, 2,0 г хлорида натрия, 0,1 г -цистеина,1,0 мл твина, 0,15 г агара, 30,0 г глюкозы и воду дистиллированную - до 1,0 л, и их культивирование в течение 16-20 часов, при этом восстановленные культуры штаммовпродуцентов вносят в количестве 1-5 от объема питательной среды, культивирование штамма- 352 - Д осуществляют при температуре от 3638 С, а штамма- 1190 - Д, при температуре от 32-34 С, полученный посевной материал по отдельности вносят в количестве 7-10 от общего объема получаемого препарата в накопительную среду, содержащую молочную сыворотку и 40 -ный раствор глюкозы в количестве 5 , и осуществляют параллельное накопление бактериальных масс в течение 16-20 часов при температуре 36-38 С для штамма- 352 - Д и температуре 32-34 С для штамма- 1190 - Д, полученные бактериальные массы охлаждают до температуры 812 С и смешивают в соотношении 11, при этом общее количество лактобацилл в полу 3 14987 1 2011.10.30 ченном препарате составляет не менее 107 КОЕ/см 3, доводят значениедо 6,0-6,5 и охлаждают до температуры 2-6 С. Кроме того, поставленная задача достигается тем, что препарат для профилактики или лечения мастита у коров, включающий штаммы-продуценты лактобацилл, питательную среду, в качестве штаммов-продуцентов лактобацилл содержит штамм- 352 - Д и штамм- 1190 - Д в соотношении 11 с общим количеством штаммов-продуцентов лактобацилл не менее 107 КОЕ/см 3, и каждого штамма-продуцента в препарате содержится 7-10 от общего объема препарата. Предлагаемый препарат является экологически чистым пробиотическим препаратом для профилактики и лечения мастита у коров, проявляет антимикробные свойства в отношении(зона задержки роста 20-25 мм),(зона задержки роста 18-22 мм),(зона задержки роста 20-22 мм), а предлагаемый способ получения препарата позволяет производить препарат на основе отечественных штаммов. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 г. из бактериального концентрата для силоса. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности и ему присвоен номер 1190- Д. Таксономическая принадлежность.относится к семейству , родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 1190 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид коротких, палочковидных,правильной формы, попарно сцепленных или цепочек грамположительных клеток, не образующих капсул и спор. Физиолого-биохимические признаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 322 С. На плотной питательной среде образует мелкие круглые колонии, глубинные колонии лодочкообразной формы. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов за исключением арабинозы, раффинозы с образованием -молочной кислоты, газ из глюкозы не образует, не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает,аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный, устойчив к 6 соли, обладает сильными кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята - 6,0 часа), предельная кислотность в молоке достигает 210 , образует сгусток плотной консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 1190 - Д - штаммпродуцент проявляет антимикробные свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 21 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 15 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм- 1190 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефалексину, фурадонину,рифампицину, тетрациклину, стрептомицину, меропенему, цефоперазону, эритромицину,цефотаксиму, доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к фурагину, сизомицину,олеандомицину, левомицетину, ломефлоксацину, азитромицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину, неомицину,4 14987 1 2011.10.30 канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к бацитрацину, цефиксиму, полимиксину и ванкомицину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). Условия хранения. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре -18-40 С. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц, при условии хранения при температуре 42 С. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 г. из Вологодской закваски мезофильных палочек (из пищеварительного тракта крупного рогатого скота). Штамм-352 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности и ему присвоен номер 352, родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 352 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид длинных палочек (длиной от 3 до 40 мкм, толщиной 1,5-1 мкм) правильной формы, одиночные и соединенные попарно. Клетки неподвижны, не образуют спор и капсул, грамположительны. Физиолого-биохимические признаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 372 С. На плотных питательных средах образует колонии поверхностные - светлые, локонообразные, глубинные - в виде паучков. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов за исключением арабинозы, мелецитозы, мелибиозы, раффинозы, рибозы, сорбита с образованием- молочной кислоты, газ из глюкозы не образует, не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный, устойчив к 2 соли, обладает сильными кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята 3,5 часа), предельная кислотность в молоке достигает 390 , образует сгусток вязкой консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 352 - Д - штаммпродуцент проявляет антагонистические свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 24 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 18 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 14 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 16 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 12 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм- 352 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефиксиму, цефалексину, фурадонину, фурагину, тетрациклину, стрептомицину, олеандомицину, меропенему, левомицетину, цефоперазону, азитромицину, ванкомицину, эритромицину, цефотаксиму,доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к бацитрацину, рифампицину, сизомицину,неомицину, канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к полимиксину и ломефлоксацину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). 14987 1 2011.10.30 Условия хранения. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре -1840 С. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц, при условии хранения при температуре 42 С. Таблица 1 Чувствительность штаммов- 352 - Д - штаммпродуцент и-1190 - Д - штамм-продуцент к антибиотикам Зона задержки роста тестируемого микроорганизма, мм Содержание Диски с фурадонином Диски с фурагином Диски с рифампицином Диски с сизомицином Диски с тетрациклином Диски со стрептомицином Диски с полимиксином Диски с олеандомицином Диски с норфлоксацином Диски с неомицином Диски с меропенемом Диски с левомицетином Диски с ломефлоксацином Диски с цефоперазоном Диски с азитромицином Диски с ванкомицином Диски с эритромицином Диски с канамицином Диски с цефотаксимом Диски с доксициклином Бензилпенициллина натриевая соль Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - микроорганизмы устойчивы к данному препарату б) задержка роста до 15 мм - микроорганизмы малочувствительны в) задержка роста от 15 до 25 мм - чувствительны г) задержка роста более 25 мм - микроорганизмы высокочувствительны. 6 Таблица 2 Антимикробные свойства штаммов- 352 - Д штамм-продуцент и-1190 - Д - штамм-продуцент в отношении патогенных микроорганизмов. Зоны задержки роста патогенных микроорганизмов, мм Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - патогенные микроорганизмы устойчивы к штаммуантагонисту б) задержка роста до 15 мм - патогенные микроорганизмы малочувствительны к штамму-антагонисту в) задержка роста от 15 до 25 мм - патогенные микроорганизмы чувствительны к штамму-антагонисту г) задержка роста более 25 мм - патогенные микроорганизмы высокочувствительны к штамму-антагонисту. При производстве препарата в качестве накопительной среды используется подсырная или подтворожная молочная сыворотка, которая представляет собой однородную жидкость желто-зеленого цвета без посторонних примесей, допускается наличие белкового осадка. Вкус и запах свойственный молочной сыворотке для творожной - вкус слегка кисловатый, для подсырной - от солоноватого до соленого 7. По органолептическим показателям подсырную сыворотку можно отнести к категории удовлетворительных, творожную сыворотку - к категории оптимальных 8. Молочная сыворотка, получаемая при производстве сыров и творога, в своем составе имеет в среднем 6-7 сухого вещества или половину от имеющегося в молоке. При этом углеводы занимают 72 , белковые вещества - 14 , минеральные - 8 . 9. Состав углеводов молочной сыворотки аналогичен углеводному составу молока. Углеводы представлены в основном лактозой, а также продуктами ее гидролиза - глюкозой и галактозой. Имеются сведения о присутствии арабинозы и лактулозы 10. Липидный комплекс представлен, как и в цельном молоке, молочным жиром 11. В сыворотке содержится 0,05-0,1 жира, что обусловлено его содержанием в исходном сырье и технологией производства основного продукта. Молочный жир в сыворотке диспергирован больше, чем в молоке, что положительно влияет на его усвояемость 12. Из белковых веществ в молочной сыворотке содержатся некоторые фракции казеина и все сывороточные белки - лактоальбумин, лактоглобулин, эвглобулин и псевдоглобулин 8. Белки молочной сыворотки более полноценны, чем казеин, так как в них содержится гораздо больше серосодержащих аминокислот. Они отличаются высоким содержанием аспарагиновой и глютаминовой кислот, лейцина 13. В молочной сыворотке спектр небелковых соединений более выражен. Небелковые азотистые соединения представлены свободными аминокислотами, мочевиной, мочевой и 7 14987 1 2011.10.30 гиппуровой кислотами, креатином и пуриновыми основаниями 14. В молочной сыворотке обнаружено также некоторое количество свободных аминокислот 8, 13. Причем количество свободных аминокислот в молочной сыворотке в 4-10 раз больше, чем в молоке 14. Так, в цельном молоке имеется от 50 мг/л свободных аминокислот, а в молочной сыворотке 133-450 мг/л или в 6-9 раз больше. Это объясняется воздействием сычужного фермента и молочнокислых микроорганизмов, обуславливающих частичный гидролиз белков 13. Большое значение имеет и то, что в молочной сыворотке содержатся почти все незаменимые аминокислоты 8, 13. По химическому составу молочная сыворотка характеризуется высоким содержанием минеральных веществ. Минеральные вещества включают органические и неорганические соединения в свободном и связанном состоянии. В молочной сыворотке обнаружено более 30 макро-, микро- и ультрамикроэлементов, в том числе введенные при переработке молока (кальций) и сорбированные со стенок технологического оборудования (олово,медь, железо) 15, 16. Из макроэлементов в ней содержится 0,09-0,19 калия, 0,0090,02 магния, 0,04-0,11 кальция, 0,03-0,05 натрия, 0,04-0,10 фосфора 17. Витаминный состав обеднен жирорастворимыми витаминами, но обогащен пиридоксином (6),холином и рибофлавином (2). Количество пиридоксина, холина и иногда рибофлавина в сыворотке превышает его содержание в молоке, что предопределено жизнедеятельностью молочнокислых бактерий 8. По наличию витаминов 6, 12 и С она превосходит обезжиренное молоко и пахту. Содержание витаминов сыворотки подвержено колебаниям и при хранении резко снижается 18. Ферменты представлены всеми группами гидролаз, фосфорилаз, расщепления, катализа и окисления, переноса и изомеризации. Органические кислоты представлены в основном молочной, лимонной и нуклеиновыми кислотами 8. Пример 1. Способ получения препарата. 1. Восстановление лиофилизированных культур штаммов. Ампулы с лиофилизированной культурой- 352 - Д штамм-продуцент и лиофилизированной культурой- 1190 Д - штамм-продуцент тщательно протирают ватой, смоченной 75 -ным раствором этилового спирта, после чего, соблюдая правила асептики, вскрывают ее. Затем в ампулу вносят 0,5-1,5 см 3 физиологического раствора или стерильной питательной среды, аккуратно перемешивают до растворения и содержимое переносят в пробирку с 10-15 см 3 стерильной питательной среды. Культивирование штамма- 352 Д проводят при температуре от 36-38 С, культивирование штамма- 1190 - Д - при температуре от 32-34 С в течение 16-20 часов. Восстановление штаммов-продуцентов лактобацилл проводится по отдельности и параллельно на питательной среде. Состав питательной среды панкреатический гидролизат казеина - 20,0 г дрожжевой экстракт - 5,0 г пептон - 5,0 г хлорид натрия - 2,0 г -цистеин - 0,1 г твин - 1,0 мл агар 0,15 г глюкоза - 30,0 г вода дистиллированная - до 1,0 литра.среды 6,0-6,5. Среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 15 мин. 2. Восстановленные штаммы- 352 - Д и- 1190 - Д используются для получения посевного материала путем внесения их по отдельности параллельно в 500-700 см 3 питательной среды в количестве 1-5 от объема питательной среды и культивируются при температуре от 36-38 С - штамм- 352 - Д, а штамм- 1190 - Д при температуре от 32-34 С в течение 16-20 часов для получения посевного материала. 3. Вносят посевной материал каждого штамма-продуцента лактобацилл по отдельности параллельно в молочную сыворотку, которая содержит 540 -ного раствора глюкозы, в следующем соотношении 7-10 посевного материала- 352 - Д от общего объема препарата,8 14987 1 2011.10.30 7-10 посевного материала- 1190 - Д от общего объема препарата,80-86 молочной сыворотки от общего объема препарата. Накопление бактериальной массы осуществляется при температуре от 36-38 С штамм- 352 - Д, а штамм-1190- Д - при температуре от 32-34 С в течение 16-20 часов. 4. Охлаждается накопленная бактериальная масса каждого штамма-продуцента в молочной сыворотке до температуры от 8 до 12 С, затем смешивают бактериальную массу каждого штамма-продуцента в соотношении 11, устанавливают значение 6,0-6,5. 5. Готовый препарат разливается во флаконы для лекарственных препаратов и охлаждается до температуры 2-6 С. Препарат хранится при температуре от 2-6 С в течение 3 месяцев. Препарат представляет собой жидкость в виде суспензии от темно-соломенного до коричневого цвета с легкоразбивающимся осадком, запах слабый специфический кисломолочный. Источники информации 1. Патент 2012342, МПК 5 А 6135/66, 1994. 2. Патент 2102075, МПК 6 А 6135/74, 1998. 3. Патент 2064299, МПК 6 А 6135/74, 1996. 4. Патент 2012342, МПК 5 А 6135/66, 1994. 5. Заявка 92009800, МПК 6 А 6135/66, 1997. 6. Патент 2102075, МПК 6 А 6135/74, 1998. 7. Барабанщиков Н.В. Молочное дело. - М. Колос, 1983. - 414 с. 8. Храмцов А.Г. Рациональное использование белково-углеводного сырья // Молочная промышленность. - 1994. -1. - С. 8-9. 9. Нестеренко Н., Волкова Н., Давыдянц Л. Использование молочной сыворотки // Молочное и мясное скотоводство. - 1990. - 5. - С. 13-15. 10. Семенищев А.И. Кисломолочные продукты при выращивании молодняка. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. Колос, 1983. - 76 с. 11. Храмцов А.Г. Рациональное использование белково-углеводного сырья // Молочная промышленность. - 1994. - 1. - С. 8-9. 12. Изучение пищеварения у жвачных Метод. указания / Подгот. В.Н.Курилов,В.В.Севастьянова, В.Н.Коршунов и др. - 1975. - 145 с. 13. Давидов Р.Б., Файнчар Б.И. Питательная ценность и биологические свойства молочной сыворотки // Молочная промышленность. - 1971. -12. - С. 12-14. 14. Осипова Н.В. Молочная сыворотка - ценный кормовой продукт // Интенсификация производства и использования кормов Тез. зональной науч. конф. - Горький Горьковский СХИ, 1998.- С. 88. 15. Арсентьева Н.Б. Проблема полного и рационального использования молочной сыворотки в условиях рыночной экономики // НТИ и рынок. -1996. -2. - С. 43-44. 16..,. . , 1977. - Р. 20-23. 17. Нагдалиев Ф.А., Фенько Г.К. Переваримость и всасывание азотистых веществ корма у телят // Зоотехния. - 2000. -2. - С. 18-20. 18. Пономарев А.Ф. Производство кормов и рациональные способы их использования. Белгород Крестьянское дело, 1999. - 363 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9