Способ получения нуклеината натрия

07 21/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕИНАТА НАТРИЯ(71) Заявитель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(72) Авторы Трухачева Татьяна Викторовна Губина Людмила Петровна Ермоленко Татьяна Михайловна Дидоренко Антонина Ивановна Царенков Валерий Минович Петров Петр Тимофеевич(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(57) Способ получения нуклеината натрия, включающий экстракцию рибонуклеиновой кислоты из биомассы дрожжей, отделение биомассы, обработку экстракта протеолитическим ферментом, коагуляцию белковых примесей с последующим отделением их от экстракта, осаждение рибонуклеиновой кислоты в виде кальциевой соли с последующим переосаждением минеральной кислотой, растворение рибонуклеиновой кислоты в растворе едкого натра и осаждение нуклеината натрия органическим растворителем, отличающийся тем, что перед осаждением нуклеината натрия в раствор вносят хлористый натрий до достижения концентрации 0,5-10,0 или эквимолярные количества гидроокиси натрия и хлористоводородной кислоты до достижения концентрации хлористого натрия в растворе 0,085-1,7 М, а в качестве органического растворителя используют этанол, ацетон или изопропанол при объемном соотношении раствора нуклеината натрия и органического растворителя 1(3-10).(56)2081915 1, 1997.393319, 1933.52083384 , 1977.1661217 1, 1991. Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для получения медицинских препаратов. Известен способ получения рибонуклеината натрия, описанный в книге Земскова В и др. Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига Зинатне, 1985. - С. 7-8 1. Способ включает экстракцию РНК из дрожжей 10-12 раствором хлористого натрия при температуре 100-110 с последующим отделением раствора РНК от дрожжевого шлама и осаждением соляной кислотой. Выпавшую в осадок РНК промывают этиловым спиртом и сушат. Для очистки от пигментов и белков РНК растворяют в воде и доводят рН до 8,0-8,2 добавлением едкого натра. Затем к раствору добавля 6691 1 ют панкреатин и выдерживают около часа при температуре 37-40 . Осаждение нуклеиновой кислоты проводят охлажденным и подкисленным соляной кислотой до рН 1-2 этиловым спиртом. Осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением гидроокиси натрия. Нуклеинат натрия осаждают из полученного раствора этиловым спиртом, осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом и сушат. Недостатком известного способа является сложность его осуществления и невысокое качество конечного продукта. Прототипом является способ получения нуклеината натрия, описанный в патенте Российской федерации 2081915 2. Способ включает экстракцию К из биомассы дрожжей в щелочном растворе с рН 7,0-9,5 с добавлением хлористого натрия или без него при температуре 60-100 С, отделение биомассы от полученного экстракта любым из известных способов, обработку экстракта протеолитическими ферментами, коагуляцию белковых примесей (рН 3,8-4,2 температура 80-100 , выдерживание 10-15 мин.), отделение образовавшихся осадков любым из известных методов, высаждение РНК из раствора в виде кальциевой соли РНК путем добавления хлористого кальция, перевод кальциевой соли РНК в свободную РНК с использованием минеральных кислот, отделение, промывку и сушку РНК известными методами, растворение РНК в воде с добавлением едкого натра до рН 6,2-6,5 и высаждение нуклеината натрия из раствора этиловым спиртом с последующей промывкой и сушкой. Заявляемое изобретение направлено на повышение качества получаемого нуклеината натрия. Указанный результат достигается тем, что способ получения нуклеината натрия включает экстракцию РНК из биомассы дрожжей в щелочном растворе с рН 7,0-9,5 с добавлением хлористого натрия или без него при температуре 60-100 , отделение биомассы от полученного экстракта любым из известных способов, обработку экстракта протеолитическими ферментами, коагуляцию белковых примесей (рН 3,8-4,2 температура 80-100 ,выдерживание 10-15 мин), отделение образовавшихся осадков любым из известных методов, высаждение РНК из раствора в виде кальциевой соли путем добавления хлористого кальция, перевод кальциевой соли РНК в свободную РНК с использованием минеральных кислот, отделение, промывку и сушку РНК известными методами, растворение РНК в воде с добавлением едкого натра до рН 6,2-6,5 и затем добавление хлористого натрия до достижения концентрации последнего в растворе 0,5-10 или добавление едкого натрия и кислоты хлористоводородной в эквивалентных количествах до достижения концентрации хлористого натрия в растворе 0,085-1,7 и последующее высаждение нуклеината натрия из раствора этиловым спиртом или другим растворителем, в частности, ацетоном или изопропанолом с последующей промывкой и сушкой. Отличительными признаками заявляемого способа являются добавление в щелочной раствор РНК хлористого натрия, который вводится в виде соли натрий хлористый или в виде гидроокиси натрия и кислоты хлористоводородной в эквимолярных соотношениях, затем высаждение нуклеината натрия органическим растворителем добавление к раствору рибонуклеиновой кислоты в гидроокиси натрия кислоты хлористоводородной в эквимолярном соотношении до достижения концентрации хлористого натрия в растворе 0,085-1,7 . для высаждения нуклеината натрия из раствора в качестве органического растворителя используют этанол, ацетон, изопропанол при соотношении (об/об) от 13 до 110. Добавление хлористого натрия в раствор нуклеината натрия перед его высаждением из раствора органическими растворителями оказывает существенное влияние на процесс формирования осадка, его структуру и цвет, а также время, необходимое для осаждения. Необходимая концентрация хлористого натрия в растворе может достигаться путем добавления хлористого натрия или едкого натра и кислоты хлористоводородной в эквивалентных количествах. 2 6691 1 В процессе проведения экспериментов проверялось влияние количества добавляемого в раствор хлористого натрия на качество получаемого препарата и скорость его осаждения из раствора после добавления органического растворителя, а также влияние используемого растворителя на качество получаемого препарата нуклеина натрия. Установлено, что если высаждать нуклеинат натрия из раствора РНК со щелочью при рН 6,2-6,5 путем добавления этанола или другого растворителя, например ацетона или изопропанола, получается осадок гелеобразной структуры, который плохо отделяется из раствора, его неудобно промывать растворителем, а после высушивания препарат нередко имеет серо-коричневый оттенок. Добавление хлористого натрия в раствор перед добавлением растворителя способствует структуризации осадка, образующегося после прибавления растворителя, образованию осадка в виде порошка, позволяет получить осадок белого цвета. Количество хлористого натрия, которое необходимо добавить в раствор для достижения желаемого эффекта, определяли опытным путем. Если в раствор добавлять хлористый натрий в количестве, создающем концентрацию в растворе менее 0,5 , нуклеинат натрия высаждается в виде сероватой гелеобразной массы. То же самое происходит и при добавлении в раствор РНК едкого натра и кислоты хлористоводородной в эквивалентных количествах до достижения концентрации хлористого натрия в растворе менее 0,085 , что соответствует концентрации хлористого натрия 0,5 . Если количество хлористого натрия, добавляемого в раствор увеличить до достижения концентрации более 10 , или добавить едкий натр и кислоту хлористоводородную в эквивалентных количествах до достижения концентрации хлористого натрия более 1,7 ,что соответствует концентрации хлористого натрия 10 , получается белый порошкообразный осадок, который имеет более низкое содержание фосфора, чем требуется для фармакопейного препарата натрия нуклеинат. Для осаждения нуклеината натрия из раствора используют любой органический растворитель, например этанол, ацетон, изопропанол или др., при соотношении (об/об) от 13 до 110. Сущность заявляемого изобретения поясняется примерами его реализации. Пример 1. 70 кг исходного сырья, в качестве которого использованы хлебопекарные дрожжи, заливают 35 л 1 водного раствора гидроокиси натрия с рН 8,0, добавляют 1,2 кг хлористого натрия, нагревают до температуры 85 при перемешивании и выдерживают при достигнутой температуре в течение 30 мин для осуществления экстракции. После окончания процесса экстракции дрожжевую биомассу подают на сепаратор для отделения клеточного шлама. Полученный экстракт обрабатывают любым из известных ферментных препаратов,содержащим протеолитические ферменты, например протосубтилином. Расход коагулянта 0,5 г/л. Процесс ферментолиза осуществляется в течение 60 мин при температуре 50-55 ,рН 6,5-7,0 и постоянном перемешивании. После завершения процесса ферментолиза доводят рН реакционной среды до значения 3,8-4,2 добавлением 18 раствора соляной кислоты. Затем экстракт нагревают при перемешивании до температуры 90 , выдерживают при достигнутой температуре 10 мин. Отделение выпавших осадков осуществляют на сепараторе. В полученный осветленный раствор РНК вносят хлористый кальций, в результате чего выпадает в осадок нерастворимая кальциевая соль РНК. Полученный осадок отфильтровывают, ресуспендируют, промывают охлажденной до 0 -5 водой, а затем доводят рН суспензии до 1-2 добавлением 18 раствора соляной кислоты. В результате этого в осадок выпадает свободная РНК. Ее отделяют от раствора методом сепарации, промывают водой. 3 6691 1 После промывки РНК растворяют в воде с добавлением едкого натра до рН 6,2-6,5 в полученный раствор добавляют хлористый натрий в количестве 2 от объема раствора,перемешивают до растворения хлористого натрия и нагревают до температуры 80 . Осветление раствора нуклеината натрия осуществляют методом сепарации. Высаждение нуклеината натрия осуществляют добавлением осветленного, охлажденного раствора нуклеината натрия при постоянном перемешивании в 3-кратный объем охлажденного до 05 ацетона. Осадок промывают ацетоном и сушат. Пример 2. 70 кг исходного сырья, в качестве которого использованы хлебопекарные дрожжи, заливают 35 л 1 водного раствора гидроокиси натрия с рН 8,0, добавляют 1,2 кг хлористого натрия, нагревают до температуры 95 при перемешивании и выдерживают при достигнутой температуре в течение 25 мин для осуществления экстракции. После окончания процесса экстракции дрожжевую биомассу подают на центрифугу для отделения клеточного шлама. Полученный экстракт обрабатывают любым из известных ферментных препаратов,содержащим протеолитические ферменты, например протосубтилином. Расход коагулянта 0,5 г/л. Процесс ферментолиза осуществляется в течение 60 мин при температуре 50-55 ,рН 6,5-7,0 и постоянном перемешивании. После завершения процесса ферментолиза доводят рН реакционной среды до значения 3,8-4,2 добавлением 18 раствора соляной кислоты. Затем экстракт нагревают при перемешивании до температуры 80 , выдерживают при достигнутой температуре 15 мин. Отделение выпавших осадков осуществляют на центрифуге. В полученный осветленный раствор РНК вносят хлористый кальций, в результате чего выпадает в осадок нерастворимая кальциевая соль РНК. Полученный осадок отфильтровывают, ресуспендируют, промывают охлажденной до 0 -50 водой, а затем доводят рН суспензии до 1-2 добавлением 18 раствора соляной кислоты. В результате этого в осадок выпадает свободная РНК. Ее отделяют от раствора методом фильтрования, промывают водой. После промывки в раствор РНК добавляют едкий натр и кислоту хлористоводородную в эквивалентных количествах до достижения концентрации хлористого натрия в растворе 0,5 , перемешивают, нагревают до температуры 80 . Осветление раствора осуществляют методом центрифугирования. Высаждение нуклеината натрия осуществляют добавлением осветленного, охлажденного раствора нуклеината натрия при постоянном перемешивании в 10-кратный объем охлажденного до 0-5 спирта этилового. Осадок промывают спиртом и сушат. Полученный таким образом препарат представляет собой белый с сероватым оттенком порошок, который легко растворим в воде с образованием опалесцирующих растворов и практически не растворим в 95 этаноле. Содержание основного вещества в нем составляет более 90 , белковые примеси отсутствуют. Остальные примеры для удобства сведены в представленных ниже таблицах. В табл. 1 приведены данные по получению нуклеината натрия при использовании для его осаждения хлористого натрия в различных количествах и обосновывающие выбор дозы 0,5-10 . В табл. 2 приведены данные по получению нуклеината натрия при использовании для его осаждения гидроокиси натрия кислоты хлористоводородной в эквимолярных соотношениях и обосновывающие выбор концентрации 0,085-1,7 , что соответствует концентрации хлористого натрия 0,5-10 . В табл. 3 приведены данные по эффективности применения для осаждения нуклеината натрия из раствора различными растворителями и их соотношений с раствором. 4 6691 1 Из представленных в табл. 1 данных следует, что добавление хлористого натрия в количестве меньше нижнего предела, указанного в формуле изобретения, т.е. ниже 0,5 приводит к образованию осадка гелеобразной структуры, который плохо отделяется от раствора и при высушивании имеет серо-коричневый оттенок. Добавление хлористого натрия выше предела, указанного в формуле изобретения, т.е. больше 10 приводит к образованию белого порошкообразного осадка, который имеет более низкое содержание фосфора, чем требуется для фармакопейного препарата натрия нуклеинат. При использовании трех видов сырья (дрожжи хлебопекарные, дрожжи пивные, БВК),трех различных растворителей и добавлении хлористого натрия в количестве 0,5-10 получают белый порошкообразный осадок с содержанием фосфора не ниже 80 , что соответствует требованиям качества для фармакопейного препарата натрия нуклеинат. Таблица 1 Спирт этиловый (13) Серо-коричневатый порошок Спирт этиловый (13) Беловато-сероватый порошок Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Ацетон (13) Белый порошок с кремоватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт изопропило- Белый порошок вый (13) с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с кремоватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с кремоватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком Спирт этиловый (13) Белый порошок с сероватым оттенком 1. Дрожжи Спирт этиловый 0,080 хлебопекарные(13) 2. Дрожжи Спирт этиловый 0,085 хлебопекарные(13) 3. Дрожжи Спирт этиловый 0,10 М хлебопекарные(13) 4. Дрожжи Ацетон (13) 0,30 М хлебопекарные 5. Дрожжи Спирт этиловый 0,50 М хлебопекарные(13) 6. Дрожжи Спирт изопропи 0,75 хлебопекарные ловый (13) 7. Дрожжи Спирт этиловый 1,00 М хлебопекарные(13) 8. Дрожжи Спирт этиловый 1,15 хлебопекарные(13) 9. Дрожжи Спирт этиловый 1,30 М хлебопекарные(13) 10. Дрожжи Спирт этиловый 1,50 М хлебопекарные(13) 11. Дрожжи Спирт этиловый 1,60 хлебопекарные(13) 12. Дрожжи Спирт этиловый 1,70 хлебопекарные(13) 13. Дрожжи Спирт этиловый 1,75 хлебопекарные 13) 14. Дрожжи пивные Спирт этиловый 0,50(13) 15. БВК Спирт этиловый 0,50 Цвет Серо-коричневатый порошок Беловато-сероватый порошок Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с кремоватым оттенком Белый порошок с кремоватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с кремоватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Белый порошок с сероватым оттенком Из представленных в табл. 2 данных следует, что добавление хлористого натрия, который вводится в виде едкого натра и соляной кислоты в эквимолярных соотношениях, в количестве меньше нижнего предела, указанного в формуле изобретения, т.е. ниже 0,085 приводит к образованию осадка гелеобразной структуры, который плохо отделяется от раствора и при высушивании имеет серо-коричневый оттенок. Добавление хлористого натрия выше предела, указанного в формуле изобретения, т.е. больше 1,7 приводит к образованию белого порошкообразного осадка, который имеет более низкое содержание фосфора, чем требуется для фармакопейного препарата натрия нуклеинат. При использовании трех видов сырья (дрожжи хлебопекарные, дрожжи пивные, БВК),трех различных растворителей и добавлении хлористого натрия в виде едкого натра и соляной кислоты в эквимолярных соотношениях в количестве 0,085-1,7 , получают белый порошкообразный осадок с содержанием фосфора не ниже 80 , что соответствует требованиям качества фармакопейного препарата натрия нуклеинат. 6 Спирт этиловый Ацетон Ацетон Ацетон Ацетон Ацетон Ацетон Спирт изопропиловый Спирт изопропиловый Спирт изопропиловый Спирт изопропиловый Спирт изопропиловый Спирт изопропиловый Из представленных в табл. 3 данных следует, что при использовании одного вида сырья, одной дозы натрия хлористого и трех растворителей (спирта этилового, ацетона,спирта изопропилового) при соотношении растворитель раствор нуклеината натрия, как 21, потери в маточном растворе наибольшие и составляют 2 и более, при соотношении растворитель раствор нуклеината натрия, как 111, потери в маточном растворе такие же,как и при соотношении 101, но расход растворителя больше, и суммарные потери в маточном растворе также будут больше. 7 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.