Способ иммунокоррекции при распространенном гнойном перитоните в эксперименте у животного

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИММУНОКОРРЕКЦИИ ПРИ РАСПРОСТРАНЕННОМ ГНОЙНОМ ПЕРИТОНИТЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У ЖИВОТНОГО(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Косинец Владимир Александрович Адаменко Геннадий Петрович Матусевич Евгений Анатольевич(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56) САЧЕК М.Г. и др. Применение креатинфосфата в хирургии. - Витебск,1998. - С. 100-103. Цитофлавин Сборник научных статей, опубликованных в периодической печати в 2006-2007 гг. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 18-28.2122448 1, 1998.2026678 1, 1995.1673122 1, 1991. БУЛИГИН Г.В. и др. Хирургия. - 2010.5. - С. 65-71.(57) Способ иммунокоррекции при распространенном гнойном перитоните в эксперименте у животного, включающий внутривенное введение метаболического средства, отличающийся тем, что в качестве метаболического средства вводят Цитофлавин из расчета 28,6 мг янтарной кислоты на кг массы тела в течение пяти суток в послеоперационном периоде. Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и применяется для метаболической иммунокоррекции при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. По-прежнему остается сложной проблема комплексного лечения распространенного гнойного перитонита. Адекватность и полнота хирургического вмешательства, рациональная антимикробная терапия не всегда определяют снижение интенсивности системной воспалительной реакции, а также вероятность развития осложнений и исход заболевания 1, 2. Во многом определяющая роль здесь принадлежит состоянию системы иммунитета как наиболее вовлеченной в патологический процесс структурно-функциональной системы организма 3. Функциональные возможности иммунокомпетентных клеток тесно связаны с их метаболическим статусом и требуют поддержания определенного состояния внутриклеточных биохимических процессов 4. Утрата клетками иммунореактивности неизбежно приводит к уменьшению их количества и, как следствие, к структурной дефектности иммунной си 18439 1 2014.08.30 стемы 5. В таких условиях клетки-эффекторы системы иммунитета уже не могут адекватно выполнять свои функции, поэтому именно на этом уровне возможна эффективная фармакологическая коррекция, осуществляемая цитопротекторами и субстратными антигипоксантами 6. Прототипом предлагаемого изобретения является способ метаболической иммунокоррекции с помощью препарата Неотон - синтетического аналога внутриклеточного соединения креатинфосфата 7. Способ заключается во внутривенном введении препарата Неотон в количестве 2 г в сутки в течение 5 суток послеоперационного периода при распространенном гнойном перитоните. Креатинфосфат является буферным соединением, поставляющим фосфатную группу АДФ (аденозиндифосфат) с целью повторного синтеза АТФ (аденозинтрифосфат). Данная особенность обуславливает его ограниченную эффективность в условиях прогрессирующей митохондриальной дисфункции с недостаточным образованием АТФ и гипоэргозом иммунокомпетентных клеток. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа метаболической иммунокоррекции при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, способствующего полной нормализации митоген-активированной цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток и миграционных свойств нейтрофильных лейкоцитов. Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что применение в течении 5 суток послеоперационного периода метаболического средства Цитофлавин, содержащего янтарную кислоту, из расчета 28,6 мг янтарной кислоты на кг массы, оказывает корригирующее действие на иммунокомпетентные клетки, изменяя их свойства регуляции миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Цитофлавин - раствор для инфузий, активными компонентами которого являются янтарная кислота, никотинамид, рибоксин, рибофлавин. Многокомпонентный состав препарата предполагает разнонаправленное действие на метаболические процессы, а также стимуляцию системы антиоксидантной защиты 8. Цитофлавин применяется только внутривенно капельно в разведении на 5-10 растворе глюкозы или 0,9 растворе натрия хлорида. Изобретение поясняется следующими материалами табл. 1 - влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните табл. 2 - влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток Пейеровых бляшек при экспериментальном распространенном гнойном перитоните табл. 3 - влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток селезенки при экспериментальном распространенном гнойном перитоните табл. 4 - влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток паховых лимфоузлов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Эксперимент выполнен на 55 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы- интактные (5)- 6-часовой распространенный гнойный перитонит без хирургического лечения (5)- контрольная, хирургическое лечение перитонита (15)- хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата Цитофлавин (15)- хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата Неотон (15). Таблица 1 Влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток крови при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Митоген Примечание 1 - достоверно по сравнению с нормой 2 - достоверно по сравнению с группой 6-часового перитонита 3 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками контрольной группы 4 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками группы Неотон. Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов Применение препарата Применение препарата Контрольная группа 6-часовой Неотон Цитофлавин перитонит 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки Таблица 2 Влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток Пейеровых бляшек при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов Клет- Мики тоген Применение препарата Цитофлавин 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки Примечание 1 - достоверно по сравнению с нормой 2 - достоверно по сравнению с группой 6-часового перитонита 3 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками контрольной группы 4 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками группы Неотон. Контрольная группа Применение препарата Неотон 6-часовой Норма перитонит Таблица 3 Влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток селезенки при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов Норма Контрольная группа Применение препарата Неотон 6-часовой перитонит 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки Применение препарата Цитофлавин 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки Примечание 1 - достоверно по сравнению с нормой 2 - достоверно по сравнению с группой 6-часового перитонита 3 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками контрольной группы 4 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками группы Неотон. Таблица 4 Влияние препаратов Цитофлавин и Неотон на митоген-индуцированную активность иммунокомпетентных клеток паховых лимфоузлов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Клет- Мики тоген Примечание 1 - достоверно по сравнению с нормой 2 - достоверно по сравнению с группой 6-часового перитонита 3 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками контрольной группы 4 - достоверно по сравнению с аналогичными сутками группы Неотон. Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов Применение препарата Применение препарата Контрольная группа 6-часовой Неотон Цитофлавин перитонит 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 1-е сутки 3-и сутки 5-е сутки 18439 1 2014.08.30 Перитонит моделируют путем интраабдоминального введения аэробно-анаэробной взвеси . (штамм 0111 К 58 НИ С 130-53) и . (штамм 323) из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 часов после введения микроорганизмов в,игруппах животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняют лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животнымигрупп в послеоперационном периоде (в течение 5 суток) ежедневно внутривенно капельно вводят препараты Цитофлавин (28,6 мг янтарной кислоты на 1 кг массы) и Неотон (0,05 г на 1 кг массы) соответственно, животнымгруппы 0,9 раствор натрия хлорида/ Животных с распространенным гнойным перитонитом выводят из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 ч после заражения, ,игрупп - на 1, 3 и 5 сутки после операции. Для иммунологического исследования выполняют забор венозной крови, селезенки,Пейеровых бляшек и подкожных лимфатических узлов. Из данных органов готовят клеточные суспензии (10 /мл) с использованием культуральной среды (КС), состоящей из среды -1640 (, США), 10 мМ , 2 мМ-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. Полученные клеточные суспензии центрифугируют в двойном градиенте раствора фиккола-верографина. Затем мононуклеарные лейкоциты, находящиеся в интерфазном кольце, собирают и дважды отмывают в изотоническом фосфатном буфере. В части исследований мононуклеарные лейкоциты разделяют на лимфоциты и моноциты по способности последних адгезироваться на пластиковой поверхности чашек Петри. Митогениндуцированную цитокинпродуцирующую активность иммунокомпетентных клеток изучают в реакции миграции нейтрофильных лейкоцитов (РМЛ) в прямом капиллярном тесте 9. Нейтрофильные лейкоциты получают из селезенки кроликов путем центрифугирования в двойном градиенте плотности фиккола-верографина. Результаты РМЛ выражают в индексе миграции (ИМ), который определяли по формуле ИМ количество НЛ, мигрировавших из капилляров с митогениндуцированными клетками. количество НЛ, мигрировавших из капилляров с интактными клетками Статистическую обработку данных проводят с использованием электронных пакетов анализа 6.0 и . Поскольку распределение признаков носит правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, -критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений 0,05). Проведена сравнительная оценка влияния препаратов Цитофлавин и Неотон на цитокинпродуцирующую активность митоген-активированных иммунокомпетентных клеток иммунных органов путем определения изменения миграционных свойств нейтрофильных лейкоцитов в ответ на антигенную стимуляцию клеток системы иммунитета при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Мононуклеары, моноциты и лимфоциты неодинаково влияли на миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов в ответ на антигенную стимуляцию в условиях перитонита. Эти изменения, прежде всего, характеризовались снижением продукции фактора ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов фитогемагглютинин-активированными мононуклеарными лейкоцитами (ФГА), ростом стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов моноцитами, активированными ЛПС (липополисахарид) У животных, получавших как Цитофлавин, так и Неотон (табл. 1) наблюдалось более интенсивное, по сравнению с контрольной группой, восстановление ингибиции миграции нейтрофилов крови под воздействием мононуклеарных лейкоцитов, активированных ФГА. Однако отмечалось более выраженное влияние цитофлавина. На 5 сутки послеоперационного периода на фоне применения препарата ИМ статистически достоверно не отличался от нормы. Активация мононуклеарных клеток ЛПС не вызывала значительных 7 18439 1 2014.08.30 изменений миграционных свойств нейтрофильных гранулоцитов как у интактных животных, так и в группах с экспериментальным перитонитом. При разделении мононуклеарных лейкоцитов на лимфоциты и моноциты было установлено, что моноциты всех исследуемых органов после стимуляции ЛПС (липополисахарид),но не ФГА обеспечивали значительное повышение миграции нейтрофильных лейкоцитов. На 5 сутки послеоперационного периода применение препаратов Неотон и Цитофлавин способствовало восстановлению миграционных свойств нейтрофилов венозной крови под действием ЛПС-активированных моноцитов до показателей интактных животных. В отличие от ФГА, стимуляция ЛПС . лимфоцитов иммунных органов оказывала меньшее влияние на миграцию тест-клеток. Такое действие ФГА-стимулированных лимфоцитов на нейтрофильные лейкоциты было наиболее выражено для клеток венозной крови и Пейеровых бляшек (табл. 2). Применение препаратов Цитофлавин и Неотон в большей степени способствовало снижению стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов ЛПС-активированными лимфоцитами. Действие препаратов в большей степени была направлено на модицикацию функциональной активности клеток венозной крови и Пейеровых бляшек, и в меньшей степени селезенки и подкожных лимфатических узлов (табл. 3, 4). При сравнительном анализе Цитофлавин обладал более выраженными иммунотропными свойствами, что проявлялось в интенсивной нормализации миграционной активности нейтрофильных гранулоцитов под действием митоген-активированных иммунокомпетентных клеток. Применение препаратов Цитофлавин и, в меньшей степени, Неотон в послеоперационном периоде при экспериментальном распространенном гнойном перитоните позволяет корригировать миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов. Данный эффект,учитывая фармакологические свойства препаратов, связан с возможностью восстанавливать энергетический статус иммунокомпетентных клеток исследуемых органов, что сопровождается нормализацией их митоген-активированной цитокинпродуцирующей активности. Источники информации 1...// . .,// . . - 1997. - . 225. - . 744-753. 3. Гаин Ю.М. и др. Иммунный статус при перитоните и пути его патогенетической коррекции руководство для врачей. - Минск ООО Юнипресс, 2001. - 256 с. 4. Караулов А.В. Клиническая иммунология. - М. Медицина, 2008. - 602 с. 5. Козлов В.К. Иммунопатогенез и цитокинотерапия хирургического сепсиса пособие для врачей. - СПб. Ясный свет, 2002. - 48 с. 6. Багненко С.Ф. и др. Фармакологическая коррекция метаболических нарушений при разлитом перитоните пособие для врачей. - Санкт-Петербург, 2007. - 20 с. 7. Сачек М.Г. и др. Применение креатинфосфата в хирургии. - Витебск, 1998. - С. 171. 8. Афанасьев В.В. Цитофлавин в интенсивной терапии пособие для врачей. - СПб.,2005. - 36 с. 9. Сачек М.Г., Косинец А.Н., Адаменко Г.П. Иммунологические аспекты хирургической инфекции. - Витебск, 1994. - 140 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8