Способ определения концентрации компонента в многокомпонентной люминесцентной среде

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КОМПОНЕНТА В МНОГОКОМПОНЕНТНОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ СРЕДЕ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Войтович Александр ПавловичКалинов Владимир СергеевичМартынович Евгений ФедоровичНовиков Алексей НиколаевичСтупак Александр Порфирьевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения концентрации компонента в многокомпонентной люминесцентной среде, при котором упомянутую среду возбуждают оптическим излучением с частотойи измеряют интенсивности фотолюминесценции (,рег,), (,рег,) -го и -го компонентов на частотах регистрации ,рег и ,рег соответственно, отличающийся тем, что предварительно измеряют (,рег,), (,рег,) при известных коэффициентах поглощения , -го и -го компонентов, определяют параметр , из уравнения,рег ,( ),затем в анализируемую среду с неизвестной концентрацией -го компонента вносят -й компонент с известным , измеряют (,рег,), (,рег,), из упомянутого уравнения при известных определяюти находят концентрацию-го компонента из выражения( ) с, где- молярный коэффициент экстинкции -го компонента. Изобретение относится к области количественного люминесцентного анализа, нашедшего широкое применение при определении количественного состава вещества, при контроле чистоты вещества и для измерения незначительных концентраций веществ. При количественном люминесцентном анализе регистрируется самостоятельное свечение веществ. 17819 1 2013.12.30 Люминесцентный анализ обладает высокой чувствительностью. С его помощью можно обнаружить в пробе присутствие вещества с концентрацией менее 10-10 - 10-11 г/г. Это более чем на три порядка превосходит чувствительность эмиссионного спектрального анализа 1,что позволяет с работать с малыми количествами исследуемого вещества 10-12 - 10-15 г. С помощью люминесцентного анализа можно исследовать очень небольшие объемы раствора, а также анализировать мельчайшие крупинки порошков, в которых содержатся следы других люминесцирующих веществ. Существенным ограничением использования методов количественного люминесцентного анализа являются невозможность его применения при наличии перекрывающихся полос поглощения нескольких компонентов среды, включая компонент, концентрация которого определяется присутствие рассеяния излучения в исследуемой среде требования полного совпадения условий проведения градуировки системы по эталонным образцам с известными содержаниями компонентов с условиями проведения измерений. Известен способ определения количественного состава люминесцентного вещества,позволяющий осуществлять корректировку на фоновое поглощение для исследуемого люминесцирующего вещества с относительно узким спектром излучения при одновременном присутствии посторонних веществ с относительно широким результирующим спектром люминесценции 2. Существенным ограничением применимости данного способа является требование наличия узкой полосы люминесценции измеряемого вещества по сравнению с результирующим спектром фоновой люминесценции. При этом предполагается, что фоновая люминесценция представляется слабо изменяющейся функцией в пределах полосы люминесценции измеряемого вещества. Недостатки приведенного способа измерения малых концентраций веществ определяются необходимостью сохранения геометрии измерений при градуировке и определении концентраций, обеспечением стабильности энергии возбуждения и чувствительности детектирующей системы в процессе различных измерений, ошибками измерений вследствие частичного перекрывания полос пропускания фильтров 0, -, . Кроме этого,применимость способа существенным образом ограничивается измерением концентраций только тех веществ, которые обладают достаточно узким спектром люминесценции (порядка 10 нм), например, редкоземельными элементами. Ограничивает область применимости и необходимость выполнения условия слабого изменения фонового свечения в пределах полосы люминесценции измеряемого вещества. Способ неприменим к средам,компоненты которых, включая компонент, концентрация которого определяется, имеют перекрывающиеся полосы поглощения, и к рассеивающим средам. Несоблюдение указанных требований приводит к значительным ошибкам измерений и уменьшает предел измеряемых концентраций, уменьшая чувствительность, или делает измерения невозможными. Известен способ определения концентрации люминесцентно маркированных биологических клеток, включающий процесс подавления фоновой люминесценции с целью увеличения чувствительности 3. Сущность способа заключается в том, что к используемому для люминесцентной маркировки биологических клеток раствору красителя (краситель 1),добавляется другой краситель (краситель 2), который полностью поглощает излучение,возбуждающее краситель 1, и/или его люминесценцию без оказания какого-либо влияния на флуоресценцию биологических клеток. Вследствие такого поглощения фоновый люминесцентный сигнал не проходит к измерительной системе, что обеспечивает регистрацию полезного сигнала с повышенной чувствительностью. Другим решением по устранению влияния фоновой люминесценции в рамках рассматриваемого способа является размещение между раствором красителя и маркированными биологическими клетками оптического разделяющего слоя. Такой слой представляет собой тонко диспергированный неорганический белый пигмент 2 или 23. Наличие такого слоя не только приводит к поглощению фоновой люминесценции, но и усиливает измеряемый сигнал, обусловленный люминесценцией маркированных клеток, вследствие отражения от неорганических частиц. 2 17819 1 2013.12.30 Недостатками приведенного способа является невозможность полного подавления фоновой люминесценции и точно не устанавливаемая часть отраженного полезного сигнала,что приводит к существенным ошибкам при проведении количественного люминесцентного анализа на основе данных, полученных из люминесцентных измерений. Практическое использование способа приводит к сильной зависимости полученных результатов от геометрии измерений и расположения анализируемых объектов. Диспергированный слой неорганического пигмента приводит к сильному неконтролируемому рассеянию полезного сигнала, что также вносит существенную ошибку в полученные результаты и уменьшает чувствительность метода. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ-прототип определения концентраций веществ люминесцирующих сред 4. Между интенсивностью флуоресценции (ф) вещества и его концентрациейсуществует следующая зависимость фкв. (0-)0 кв. (1)0 кв. (110-),(1) где 0 и- интенсивности возбуждающего (падающего) и выходящего из образца светового пучка соответственно кв. - квантовый выход люминесценции- коэффициент, характеризующий чувствительность прибора для измерения люминесценции- пропускание образца при длине волны возбуждения люминесценции- оптическая плотность образца при длине волны возбуждения люминесценции,пропорциональная концентрации веществ 5. Из уравнения (1) видно, что величина ф меняется в зависимости отпо экспоненциальному закону, и, следовательно, в общем случае между ф и концентрацией вещества нет линейной зависимости, что осложняет использование измерения ф для количественного анализа. При небольших значениях(0,01) в формуле (1) выражение в скобке можно разложить в ряд и, ограничиваясь линейным членом, получить равенство(2) ф 2,3 0 кв.2,3 0 кв.с 1,где- молярный коэффициент экстинкции люминесцирующего вещества при длине волны возбуждения люминесценции- концентрация люминесцирующего вещества- длина оптического пути возбуждающего света и. Таким образом, в определенных пределах оптических плотностей интенсивность ф пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества . При больших концентрациях люминесцирующего вещества эта пропорциональность нарушается. Для определения концентрации вещества по его люминесценции применяли графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах ф . Для построения калибровочного графика измеряли интенсивность люминесценции серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Полученный график представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен 2,3 0 кв.1. Измерив ф исследуемого раствора, по калибровочному графику определяли концентрацию вещества. Практическое осуществление способа определения концентрации люминесцирующего вещества заключалось в эмпирическом определении отношения между концентрацией исследуемого вещества и интенсивностью люминесцентного свечения. Предварительно устанавливали такую же зависимость для серии стандартных растворов с заранее известным количеством определяемого вещества. По данным, полученным при измерении серии стандартных растворов, строили калибровочный график, в соответствии с которым по интенсивности люминесцентного излучения анализируемого раствора определяли в нем концентрацию вещества. 3 17819 1 2013.12.30 Рассмотренный способ-прототип имеет определенные ограничения применимости и недостатки. Так, зависимость интенсивности люминесценции от концентрации вещества сохраняет линейный характер только в пределах нескольких порядков величины концентрации. При больших концентрациях люминесцирующего вещества эта пропорциональность нарушается. При малых оптических толщинах исследуемого объекта и при малых концентрациях (в отсутствие концентрационного тушения люминесценции) интенсивность свечения пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества. При увеличении оптической толщины пропорциональность нарушается, и при больших толщинах интенсивность люминесценции может не зависеть от концентрации. Это в свою очередь ограничивает применимость люминесцентного определения концентраций веществ. К недостаткам относится и невозможность количественных измерений при наличии в среде других веществ, полосы поглощения которых перекрываются с полосой поглощения анализируемого вещества. Наличие рассеяния приводит к существенным ошибкам или невозможности измерений. Задачей настоящего изобретения является определение концентраций компонента в многокомпонентной люминесцентной среде, когда оптическая плотность не является малой, когда полосы поглощения некоторых компонентов перекрываются с полосой поглощения анализируемого компонента и/или среда рассеивает излучение. Сущность изобретения поясняется фигурой, где показаны спектры поглощения (1) и люминесценции (2) при длине волны возбуждения возб.350 нм кумарина 102 и родамина, растворенных в этаноле. Указанная задача решается следующим образом. Способ определения концентрации компонента в многокомпонентной люминесцентной среде основан на измерении интенсивности люминесценции вещества. При возбуждении излучением с частотойизмеряют интенсивности фотолюминесценции (,рег,) и(,рег,) для -го и -го компонентов среды на частотах регистрации ,рег и ,рег соответственно при известных коэффициентах поглощенияиданных компонентов на частоте возбуждения, находят параметр , из соотношения,рег ,( ),затем в анализируемую среду с контролируемой концентрацией -го компонента вносят -й компонент с известным коэффициентом поглощения или концентрацией, измерив интенсивности (,рег,) и (,рег,) и зная величины , и , определяют коэффициент поглощенияи находят концентрацию -го компонента из выражения,гдеи- его молярный коэффициент экстинкции и концентрация соответственно. Способ определения концентрации компонента в многокомпонентной люминесцентной среде основан на измерении интенсивности люминесценции компонента. При возбуждении излучением с частотойизмеряют интенсивности фотолюминесценции (,рег,) и(,рег,) для -ого и -ого компонентов среды на частотах регистрации ,рег и ,рег соответственно, определяют соотношение (,рег,)/(,рег,), затем добавляют в среду дополнительное количество одного из компонентов, создающую величину коэффициента поглощения, например, , измеряют указанное соотношение, после этого из двух уравнений, полученных из равенства (4), находят значения коэффициентов поглощения,и концентраций обоих компонентов. Известно соотношение 6, 7, связывающее интенсивность люминесцирующего компонента в многокомпонентной среде с коэффициентами поглощения среды. Это соотношение имеет вид В уравнении (3) использованы следующие обозначения (рег) - интенсивность фотолюминесценции для -го компонента на частоте регистрации ,рег (в единичном интервале частот) при возбуждении излучением с частотой- геометрический фактор, учитывающий долю фотолюминесценции, собираемую регистрирующей системой- квантовый выход фотолюминесценции 0 - интенсивность возбуждающего излучения на входе в исследуемую среду, разделенная на частоту кванта возбуждения- коэффициент поглощения -го компонента на частоте возбуждения- толщина исследуемого образца вдоль направления распространения возбуждающего потока (,рег)(,рег)( ) 1 . Функцияопределяет нормированный контур полосы фотолюминесцен ции для -го компонента, она может задаваться аналитически или в цифровом виде. Интеграл при определенииберется по всему контуру. Суммирование в уравнении (3) ведется по всем компонентам, поглощающим на частоте , и, следовательно, показатель экспоненты равен величине 10( ). Предполагается, что в возбуждающем излучении поддерживается постоянным число фотонов при различных частотахвозбуждения. Соотношение для интегральной по спектру интенсивности фотолюминесценцииполучается из уравнения (2), если в последнем опустить множитель (,рег) и поменять частоту ,рег на частоту ,люм центра тяжести контура люминесценции. Предположим, что в среде имеются два люминесцирующих компонента и их спектры поглощения перекрываются. Интенсивности фотолюминесценции этих компонентов при возбуждении излучением с частотойвозб описываются формулой (3). Отношение этих интенсивностей (,рег,) и (,рег,) определяется как, рег ,( ),где ,1, рег, рег, рег, рег 1. Для интегральных ин тенсивностей фотолюминесценции соотношение (4) имеет вид( )( ),Соотношение (4) демонстрирует особенности, позволяющие проведение количественного люминесцентного анализа для случая многокомпонентных сред. Параметр который связывает отношения интенсивностей фотолюминесценции и коэффициентов поглощения-го и -го компонентов, зависит только от люминесцентных характеристик этих компонентов квантовых выходов, длин волн регистрации и формы контуров их фотолюминесценции. Он инвариантен относительно изменений некоторых факторов а) величины , т.е. доли фотолюминесценции, собираемой регистрирующей системой б) эффективности сбора излучения от различных участков люминесцирующей среды в) величины( ) ,1 т.е. суммарной по всем компонентам оптической плотности на частоте возбуждающего излучения. Уравнение (4) применимо к различным взаимным направлениям возбуждения и регистрации фотолюминесценции под прямым углом, фронтально и в линию. На основании вышеизложенного способ измерения концентрации компонента в многокомпонентной люминесцентной среде можно сформулировать следующим образом. 17819 1 2013.12.30 Вначале по измеренным интенсивностям (,рег,) и (,рег,) при известных коэффициентах поглощения (оптических плотностях)и( и ( на частотевозбуждения фотолюминесценции находят из уравнения (4) параметр ,. Затем в исследуемую среду, в которой следует определять концентрацию -го компонента, вводят -й компонент с известным коэффициентом поглощения (концентрацией). После этого, измерив интенсивности (,рег,) и (,рег,) и зная , и , из уравнения (4) определяют коэффициент поглощенияи концентрацию-го компонента, поскольку. Сущность изобретения демонстрируется следующими примерами. 1. Эксперименты проводились с двумя парами люминесцирующих веществ. В одной паре использовались родамин и кумарин 102, во второй - оксазин 17 и кумарин 102. Приготавливались этанольные растворы раздельно каждой из пар с различными соотношениями компонентов. Спектр поглощения одного из растворов представлен на фиг. 1, кривая 1. Наблюдаются две полосы с максимумами при 351 и 520 нм. Вторая полоса принадлежит родамину, а первая формируется поглощением как кумарина 102, так и родамина. Поэтому возбуждение ФЛ излучением с длиной волны возб 350 нм приводит к свечению обоих компонентов и к спектру, в котором полосы с максимумами при люм 430 и 546 нм принадлежат соответственно кумарину 102 и родамину (фиг. 1, кривая 2). Во всех экспериментах с этой парой использовалась длина волны возбуждения возб 350 нм. Интенсивности фотолюминесценции кумарина 102 (-ый компонент) и родамина (-й компонент) измерялись на длинах волн рег 435 и 555 нм соответственно. Длины волн регистрации выбирались, исходя из нескольких критериев максимальная интенсивность и минимальная реабсорбция ФЛ минимальный вклад в измеряемый сигнал люминесценции других компонентов среды. Создавались растворы с известными коэффициентами поглощения компонентов. Используя данные о коэффициентах и измеренные интенсивности ФЛ, из уравнения (4) определялась величина параметра ,. Специально проведенные эксперименты показали, что величина этого параметра не зависит от взаимной ориентации возбуждающего и регистрируемого потоков, функциии эффективности сбора излучения с различных участков анализируемой среды, суммарной оптической плотности( возб ) поглощения всех компонентов среды на длине волны возбуждения. Далее создавались различные растворы, в том числе значительно поглощающие на длине волны возб. В растворы вводился -й компонент с известным коэффициентом поглощения. Находились коэффициенты поглощения -ого компонента предложенным методом. Из сравнения коэффициентов, определенных этим методом и традиционным абсорбционным способом, следует, что они в пределах ошибок одинаковы. Для примера абсорбционным способом измерены коэффициенты 0,63, 0,13, 0,079, 0,012 см-1, предложенным способом в тех же средах найдены соответственно значения 0,628, 0,133, 0,0776, 0,0122 см-1. Используем десятичные коэффициенты поглощения. Приготавливались образцы с малым содержанием анализируемого компонента. Определен коэффициент 310-5 см-1. Измерение таких величин традиционным абсорбционным способом невозможно. Найденная величинапри десятичном коэффициенте экстинкции 105 -1 см-1 соответствует концентрации примерно 10-10 мольл-1 или 10-10 - 10-11 гсм-3. Возможны измерения более низких концентраций. Рассмотренный способ нахождения коэффициентов поглощения и концентраций компонента среды не зависит от величины суммарной оптической плотности на длине волны возбуждения ФЛ. Он не должен зависеть и от величины коэффициента рассеяния , если рассеяние одинаковым образом сказывается на измеряемых величинах интенсивностей ФЛ на длинах волн ,рег и ,рег. 17819 1 2013.12.30 Влияние рассеяния на определение коэффициентов поглощения проверялось экспериментально . По известным коэффициентам поглощения( возб), ( возб), при которых ( возб)( ( возб)( возб 0,088, и измеренным интенсивностям( ,рег),( ,рег) из уравнения (4) находился параметр В,. Затем в среду добавлялся рассеиватель , в результате чего оптическая плотность увеличивалась до значения(возб)возб)(возб)расс)0,22 при неизменном отношении /. Величина параметра найденного после введения рассеивателя, не отличалась от величины для нерассеивающей среды. Таким образом, метод может применяться для определения концентрации компонентов рассеивающих сред. Измерения коэффициента поглощения -го компонента в среде до и после внесения в нее рассеивателя предложенным методом дали значения 0,06 и 0,062 см-1 соответственно. Существенным отличием рассматриваемого способа от способа-прототипа является то, что определение концентрации -ого компонента предлагаемым способом можно проводить при использовании иного прибора, иных схем эксперимента, при других значениях величини( ) по сравнению с использованными при нахождении параметра ,. В способе-прототипе построение градуировочной зависимости и эксперименты по определению концентрации компонента необходимо выполнять при совершенно одинаковых условиях. Для реализации предлагаемого способа можно заблаговременно составить таблицу величин необходимых параметров , и затем использовать их при измерении концентраций. Техническим результатом изложенного способа является возможность измерения концентраций в многокомпонентной среде вне зависимости от величины суммарной оптической плотности на длине волны возбуждения фотолюминесценции. Предлагаемый способ может использоваться также в многокомпонентной одновременно поглощающей и рассеивающей среде, если рассеяние одинаковым образом сказывается на измеряемых величинах интенсивностей фотолюминесценции компонента на длинах волн их регистрации. Третьим преимуществом предлагаемого способа является его независимость от геометрии эксперимента Источники информации 1. Гришаева Т.И. Методы люминесцентного анализа Учебное пособие для вузов. СПб. АНО НПО Профессионал, 2003. - 226 с. 2. Патент США 4,150,295, МПК 21 2/02, 1979. 3. Патент США 6,420,183 1, МПК 01 21/00, 2002. 4. Барбалат Ю.А., Гармаш А.В. Люминесцентный анализ. - М. Изд-во Моск. ун-та,1998. -66 с. 5. Кунце У., Шведт Г. Основы качественного и количественного анализа. - М. Мир,1997. -424 с. 6. , , , , , //. -. 75. - 2008. - . 385-393. 7. , , , , , //. -. 106. - 2009. - . 220-226. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.