Способ предварительной оценки безопасности пестицида или его метаболита для животных и человека

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ ПЕСТИЦИДА ИЛИ ЕГО МЕТАБОЛИТА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Лахвич Федор Адамович Скоростецкая Лидия Адамовна Герловский Денис Олегович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(экспресс-методы) для токсикологогигиенической оценки материалов, изделий и объектов окружающей среды. М., 1999. - . 50-68. Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов. Киев,1988. - . 8-36.1165989 , 1985.18584 , 2006.20085942 1, 1997.31259 , 2008.6810371 1, 2004.(57) 1. Способ предварительной оценки безопасности пестицида или его метаболита для животных и человека на основе изменения активности панкреатической фосфолипазы 2 в присутствии пестицида или его метаболита по отношению к контролю, заключающийся в том, что готовят контрольную пробу путем добавления расчетного количества метгемоглобина в трис- буферном растворе к буферному раствору с 7,4-8,2,содержащему 2 и мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина, эмульгированные желчной кислотой при соотношении фосфолипид желчная кислота, равном 1(2-3), пробу разливают в кюветы, одна из которых кювета сравнения, в другую вносят панкреатическую фосфолипазу 2 в количестве 1-4 мкг/мл и регистрируют разностный спектрв диапазоне длин волн 405-423 нм, параллельно аналогичным образом готовят опытную пробу, в нее добавляют исследуемый пестицид или его метаболит в подходящем растворителе в количестве 1-10 мкг/мл, проводят преинкубацию в течение 5-20 минут, пробу разливают в кюветы, одна из которых кювета сравнения,в другую вносят панкреатическую фосфолипазу 2 в количестве 1-4 мкг/мл и регистрируют разностный спектрв диапазоне длин волн 405-423 нм, устанавливают зависи 14325 1 2011.04.30 мость измененияот времени для контрольной и опытной проб, используя указанную зависимость определяют степень изменения активности панкреатической фосфолипазы 2 под действием пестицида или его метаболита и при изменении активности фермента в опытной пробе в пределах не более 20 от контроля пестицид или его метаболит оценивают как безопасный. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве исследуемого пестицида используют действующее вещество или препаративную форму пестицида. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве желчной кислоты используют 3,12-дигидроксихолановую или 3,7,12-тригидроксихолановую кислоту. Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины,в частности к способу предварительной оценки безопасности пестицида или его метаболита для животных и человека на основе изменения активности панкреатической фосфолипазы А 2 в присутствии пестицида или его метаболита по отношению к контролю, и может быть использовано для предварительного тестирования токсичности новых биологически активных соединений, обладающих пестицидной активностью. Токсичность пестицидов изучают согласно Инструкции 1.1.11-12-35-2004 1. Острое отравление моделируют методом однократного введения препарата в желудок экспериментальных животных при помощи иглы-зонда. В опытах используют различные концентрации раствора препарата в дистиллированной воде. Вводимые дозы рассчитывают по действующему ингредиенту, чтобы объемно они не превышали физиологической вместимости желудка 2. Каждую дозу в острых опытах испытывают на 6-12 животных с последующим наблюдением в течение 14 суток с учетом характера симптомов интоксикации,количества погибших животных, срока их гибели. Количественные параметры острой токсичности препаратов определяют пробитанализом по методу Литчфильда-Уилкоксона в изложении М.Б.Беленького 3 с уточнением характеристик потенциальной опасности смертельного отравления. Острое ингаляционное отравление пестицидами проводят путем динамической ингаляционной затравки крыс в камерах Н.Ф. Боярчука. Опыты предусматривают 4-часовую динамическую затравку в двух-трех концентрациях препаратов. Контрольные животные находятся в аналогичных условиях при подаче в камеру водно-воздушного аэрозоля. Аллергенную активность, оценку местно-раздражающих и кожно-резорбтивных свойств синтезированных препаративных форм пестицидов осуществляют в однократных и повторных опытах на белых крысах и кроликах в соответствии с действующей Инструкцией 1.1.11-12-35-2004 1. Изучение аллергизирующей способности продуктов проводят на модели воспроизведения сенсибилизации на белых мышах при внутрикожном введении в основание хвоста опытным животным изучаемого продукта в дозе по 100 мкг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 11. В качестве растворителя использовали дистиллированную воду. Контрольным животным аналогично вводится дистиллированная вода и ПАФ. Выявление гиперчувствительности замедленного типа проводят на 6-е сутки опыта внутрикожным тестом опухания лапы до и через 24 часа после внутрикожного введения в апоневроз задней лапы разрешающей дозы препаратов (по 130 мкг на животное). Субхроническое отравление пестицидами воспроизводят в условиях 30-суточного введения препарата в желудок белых крыс в дозе, равной 1/10 ЛД 50. Для оценки функционального проявления кумулятивного действия препаратов в эксперименте регистрировали ряд показателей (физиологические, гематологические, биохимические, относительные коэффициенты массы тела) перед началом экспериментов и на 30-е сутки опыта. Таким образом, существующие методы определения биобезопасности пестицидов многоступенчаты и трудоемки, требуют больших временных затрат и большого количе 2 14325 1 2011.04.30 ства экспериментальных животных (мышей, крыс, кроликов), а также специальных реактивов, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения уровня токсичности применяемых в растениеводстве современных средств защиты растений. Панкреатическая фосфолипаза А 2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА 2) - фермент, который расщепляет фосфолипиды пищи, в норме находится в неактивном состоянии и активизируется только для участия в пищеварении. При патологии ФЛА 2 выделяется ацинарными клетками поджелудочной железы уже в активном состоянии. Активация выше нормы липолитических реакций с участием ФЛА 2 отражаем степень патологического состояния организма человека при многих болезнях, в том числе остром некротическом панкреатите 4, поскольку является основным фактором, ответственным за повреждение клеточных мембран и способствующим проникновению в клетку панкреатических липаз, что сопровождается изменением структуры клеточной мембраны, увеличением агрегационной способности тромбоцитов с образованием микротромбов, изменением просвета кровеносных сосудов и их проницаемости, возрастанием внутриклеточной активности ионизированного кальция на фоне образования простагландиновых субстанций. За последние два десятилетия в 40 раз увеличилась частота развитая острого панкреатита. В настоящее время среди хирургических заболеваний органов брюшной полости,требующих неотложной медицинской помощи, острый панкреатит по частоте встречаемости стоит на третьем месте после острого аппендицита и холецистита. Общая летальность при остром панкреатите достигает 21 , а при деструктивных формах - 80 . Среди выживших больных у 50-73 возникает утрата трудоспособности или выход на инвалидность на длительный период, поскольку наиболее часто заболевают люди активного трудоспособного возраста (20-60 лет). Установление на основе изменения активности ФЛА 2 возможных причин возникновения острого некротического панкреатита, который может развиться при попадании пестицидов в организм, следует отнести к приоритетным медико-социальным проблемам 4. При пищеварении, в процессе которого под действием панкреатической ФЛА 2 гидролизуются фосфолипиды, происходит эмульгирование пищи желчными кислотами. Таким образом, мицеллообразование и липолитические реакции имеют определяющее физиологическое значение для функционирования живого организма и поэтому могут быть индикатором негативного воздействия пестицидов на организм человека и животных, т.е. определения их биобезопасности при попадании в организм. Описан способ выявления эффекторного действия тралкоксидима - действующего вещества пестицида грасп и его производных путем воздействия на активность панкреатической ФЛА 2, включающий разделение продуктов фосфолипазной реакции с использованием тонкослойной хроматографии с последующим количественным определением лизофосфатидилхолина, характеризующего активность фермента (прототип) 5. Способ дал положительный результат, однако оказался применимым для определения безопасности ограниченного числа пестицидов в связи с низкой чувствительностью. Указанный способ позволяет определить 100 мкг пестицида. Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности способа предварительной оценки безопасности пестицида или его метаболита для животных и человека при расширении спектра исследуемых соединений. Поставленная задача решается способом предварительной оценки безопасности пестицида или его метаболита для животных и человека на основе изменения активности панкреатической фосфолипазы А 2 в присутствии пестицида или его метаболита по отношению к контролю, заключающийся в том, что готовят контрольную пробу путем добавления расчетного количества метгемоглобина и трис- буферном растворе к буферному раствору с 7,4-8,2, содержащему 2 и мицеллы фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина, эмульгированные желчной кислотой при соотношении фосфолипиджелчная кислота, равном 1(2-3), пробу разливают в кюветы, одна 3 14325 1 2011.04.30 из которых кювета сравнения, в другую вносят панкретическую фосфолипазу А 2 в количестве 1-4 мкг/мл и регистрируют разностный спектрв диапазоне длин волн 405-423 нм,параллельно аналогичным образом готовят опытную пробу, в нее добавляют исследуемый пестицид или его метаболит в подходящем растворителе в количестве 1-10 мкг/мл, проводят преинкубацию в течение 5-20 минут, пробу разливают в кюветы, одна из которых кювета сравнения, в другую вносят панкретическую фосфолипазу А 2 в количестве 1-4 мкг/мл и регистрируют разностный спектрв диапазоне длин волн 405-423 нм, устанавливают зависимость измененияот времени для контрольной и опытной проб, используя указанную зависимость, определяют степень изменения активности панкретической фосфолипазы А 2 под действием пестицида или его метаболита и при изменении активности фермента в опытной пробе в пределах не более 20 от контроля пестицид или его метаболит оценивают как безопасный. В качестве исследуемого соединения может использоваться действующее вещество или препаративная форма пестицида. В качестве желчных кислот используют 3,12-дигидроксихолановую или 3,7,12 тригидроксихолановую кислоту (дезоксихолевую и холевую кислоту соответственно). Неожиданно было установлено, что в процессе фосфолиполиза с участием ФЛА 2 в пробах, содержащих пестициды или их метаболиты (опытная проба), и в их отсутствие(контрольная проба) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты превращение метгемоглобина в гемихром происходит дозозависимо, что регистрируется по изменению в разной степени амплитуды дифференциального спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются пропорциональным изменением разностного спектра, который позволяет по спектральному сдвигу в области полосы Соре метгемоглобина провести измерение активности ФЛА 2 как индикатора изменений при переваривании фосфолипидов пищи в присутствии исследуемого пестицида и без него. В процессе фосфолиполиза с участием ФЛА 2 в пробах, содержащих пестициды или их метаболиты (опытная реакция) и в их отсутствие (контрольная реакция) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты - происходит превращение метгемоглобина в гемихром, что регистрируется по изменению спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются пропорциональным изменением разностного спектра. Заявляемый способ позволяет выявить изменения активности панкреатической ФЛА 2 путем установления содержания метаболитов фосфолиполиза при участии метгемоглобина в кинетическом режиме без отбора отдельных проб с использованием разностной спектрофотометрии (А 405-423) за счет моделирования условий пищеварения путем эмульгирования экзогенного субстрата в виде мицелл фосфатидилхолина яичного желтка или природного фосфатидилсерина желчными кислотами в буферном растворе с 8,0 в присутствии раствора 2 в качестве кофактора и раствора метгемоглобина в качестве индикатора, с последующим внесением в реакционную смесь исследуемого пестицида и ФЛА 2 в опытную кювету, а пробы без пестицидов - в контрольную кювету с параллельной дифференциальной регистрирующей спектрофотометрией и последующим расчетом снижения установленного в контроле уровня активности определяемого фермента известными приемами. Заявляемый способ позволяет использовать 1-10 мкг пестицида для определения его безопасности. Таким образом, заявленный способ позволяет по спектральному сдвигу в области полосы Соре метгемоглобина провести измерение активности ФЛА 2 как индикатора изменений при переваривании фосфолипидов пищи в присутствии тестируемого пестицида и без него и обеспечивает достижение результата с высокой чувствительностью (в более чем в 100 раз превышающей чувствительность способа-прототипа) на небольшом количестве доступного сырья без использования лабораторных животных. 4 14325 1 2011.04.30 На фиг. 1 представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина в присутствии и в отсутствие исследуемого пестицида На фиг. 2 представлена кинетика ингибирующего действия исследуемого соединения на активность ФЛА 2 На фиг. 3 представлена зависимость доза-эффект соединенийина активность ФЛА 2. На фиг. 4 показаны пределы чувствительности заявляемого способа на основе зависимости доза-эффект для соединения . Приведенные ниже примеры подтверждают возможность осуществления изобретения,не ограничивая его объем. Пример 1. Определение активности ФЛА 2 в присутствии 5-(2,4,6-триметилфенил)-2-(1-этоксииминопропил)-циклогексан-1,3-Диона (тралкоксидим, соединение ) - действующего вещества пестицида Грасп. Для проведения реакции готовят следующие реактивы 1. 0,05 М Трисбуфер,8,0. 2. Раствор фосфатидилхолина яичного желтка (ФХ) или фосфатидилсерина (ФС) в хлороформе с исходной концентрацией 30-50 мкмоль/мл. 3. 2 водный раствор холата натрия или дезоксихолата. 4. Раствор метгемоглобина в трисбуфере, исходная концентрация - 30-100 мкМ(по гему). Взвешивают лиофилизованный метгемоглобин, исходя из расчета, что 1 мг сухого порошка дает около 28 нмоль по гему. Добавляют буферный раствор до концентрации 0,5-1 мг/мл. Оставляют на 2-3 ч для набухания, после чего раствор хорошо перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для отделения нерастворившегося белка и апогемоглобина. Регистрируют спектр поглощения разведенного в 20-40 раз супернатанта на Спекорде - либо определяют А 406 на спектрофотометре. Рассчитывают содержание метгемоглобина (по гему) с учетом разведения и длины оптического пути, используя коэффициент молярной экстинкции метгемоглобина 162000 М-1 см-1. 5. 0,1 М раствор 2. 6. Исследуемое соединение в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО). Далее готовят реакционную смесь. Для этого выпаривают исходный раствор ФХ (ФС) в виде тонкой пленки в количестве, эквивалентном 0,756 мкмоль. Оставляют на воздухе на 30-60 мин для удаления паров хлороформа. Солюбилизируют 50 мкл 2 холата натрия в течение нескольких часов или ночи до полной прозрачности. Добавляют 0,05 М Трис буферный раствор,8,0, 63 мкл 0,1 М 2 и в последнюю очередь рассчитанное количество раствора метгемоглобина. Конечный объем реакционной смеси - 6,3 мл. Разливают по 1 мл в кюветы спектрофотометра. В опытную кювету добавляют раствор соединения , а в кювету сравнения - такое же количество растворителя (ДМСО). Было показано, что добавление данного пестицида не оказывает влияния на спектральные свойства метгемоглобина в интересующей области. Проводят преинкубацию при 20 С (37 С) в течение 5-20 мин, после чего начинают реакцию внесением от 1 до 4 мкг панкреатической ФЛА 2 свиньи с параллельной дифференциальной регистрирующей спектрофотометрией. Количество фермента выбирают таким образом, чтобы прирост продукта реакции(/) первые несколько минут был линейным. Параллельно проводят контрольную реакцию (без добавления пестицида) той же реакционной смеси с таким же количеством фосфолипазы 2 на другой паре кювет. На фиг. 1 А представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина,регистрируемые через 2 минуты после начала реакции в контрольных образцах (пунктир) и в пробах, содержащих 100 мкг (в условиях способа-прототипа) соединенияв 1 мл реакционной смеси (сплошная линия), при следующих условиях реакции ФХ 0,12 мМ,5 мкМ, 21 мМ,20 С. Разностный спектр определяют спектрофотомет 5 14325 1 2011.04.30 рически ( -, ГДР) в режиме пропускания (Т, 75-125 ) в диапазоне длин волн 360-450 нм). Его характеризует положение максимума при 423 нм с соответствующей интенсивностью поглощения 1 и положение минимума при 405 с интенсивностью поглощения 2. Изменение амплитуды дифференциального спектра (405-42312) пропорционально концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2 (фиг. 1). Сравнение амплитуды разностных спектров метгемоглобина в процессе ферментативного гидролиза ФХ в отсутствие и в присутствии соединенияпоказывает снижение интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобинав присутствии исследуемого соединения (во всех этих случаях 405-423 в опытной пробе 405-423 контрольной пробы), что свидетельствует об ингибировании ФЛА 2 в условиях реакции. Сравнивая ход кинетической кривой контрольной реакции (1, фиг. 2) и в присутствии соединения(2, фиг. 2) определяют степень изменений в активности фермента под влиянием эффектора (пестицида). Пример 2. В условиях примера 1 проводят исследование 2-пропаноил-5-(2,4,6-триметилфенил)циклогексан-1,3-диона - предшественника в химическом синтезе тралкоксидима (соединение ). На фиг. 1 Б представлены дифференциальные спектры поглощения метгемоглобина, регистрируемые через 2 мин после начала реакции в контрольных образцах (пунктир) и в пробах, содержащих 100 мкг соединенияв 1 мл реакционной смеси (сплошная линия), при следующих условиях реакции ФХ 0,12 мМ,5 мкМ, 21 мМ,20 С. Разностный спектр определяется спектрофотометрически ( -,ГДР) в режиме пропускания (Т, 75-125 ) в диапазоне длин волн 360-450 нм). Его характеризует положение максимума при 423 нм с соответствующей интенсивностью поглощения 1 и положение минимума при 405 с интенсивностью поглощения 2. Изменение амплитуды дифференциального спектра (405-42312) пропорционально концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2 (фиг. 1). Сравнение амплитуды разностных спектров метгемоглобина в процессе ферментативного гидролиза ФХ в отсутствие и в присутствии соединенияпоказывает снижение интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобинав присутствии исследуемого соединения (во всех этих случаях 405-423 в опытной пробе 405-423 контрольной пробы), что свидетельствует об ингибировании ФЛА 2 в условиях реакции. Пример 3. Установление зависимости доза-эффект при определении биобезопасности испытуемых пестицидов заявляемым способом. На фиг. 3 представлено ингибирующее действие соединенийина липолиз в зависимости от дозы. Ингибиторный эффект определяли как относительную активность (вот контроля), выраженную в условных единицах - изменения интенсивности между максимумом и минимумом в разностном спектре метгемоглобина в присутствии соединенийи(опытн./) и без них (контр./). Представлены кинетические кривые, полученные для соединения(фиг. 2) в дозе 100 мкг и без него (первичный график). Аналогичные графики служили для расчета ингибиторного эффекта в случае каждой дозы эффекторов от 1-1000 мкг при установлении зависимости доза-эффект (фиг. 3, вторичный график). Существенное подавление активности фермента под действием соединений ,от 40 до 80 , как следует из кривых на фиг. 3, наблюдается при количестве исследуемых веществ от 200 мкг, что соответствует превышению допустимой дозы (ДСД 0,002 мг/кг массы тела человека 6) в 2 раза и выше. Следовательно, пестицид может считаться биобезопасным при условии изменения активности ФЛА 2, в среднем, на 20 . Пример 4. В условиях примера 1 и 3 исследованы соединения- 2-(1-аминопропилиден)-5(2,4,6-триметилфенил)-циклогексан-1,3-дион- 6-(2,4,6-триметилфенил)-2-этил-4-этокси 6 14325 1 2011.04.30 имино-4,5,6,7-тетрагидро-1,3-бензоксазол- 6-(2,4,6-триметилфенил)-2-этил-6,7-дигидро 1,3-бензоксазол-4(5 Н)-дион- гидрохлорид 2-(1-аминопропилиден)-5-(2,4,6-триметилфенил)-циклогексан-1,3-дион, и подтверждено их эффекторное действие в тех же пределах. Пример 5. В условиях примера 1 и 3 исследован водный раствор соединения- -фосфориметил-глицина-глифосат - действующее вещество пестицидов Раундап и Шквал. В связи с тем, что добавление данного пестицида оказывает влияние на спектральные свойства метгемоглобина в интересующей области, для уравновешивания исходных спектров соединениедобавлялось в обе кюветы до внесения в опытную пробу ФЛА 2. На фиг. 4 показана зависимость доза-эффект для соединения , которая показывает высокую чувствительность заявляемого способа - возможность определять исследуемый пестицид в количестве менее 1 мкг с высокой точностью. Таким образом, на примере известных пестицидов, установлено, что использованиефосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипидов пищи позволяет достоверно оценивать безопасность пестицида для организма животных и человека. Разработанный экспресс-метод имеет явные преимущества,поскольку не требует длительных испытаний на лабораторных животных и создает благоприятные условия для определения среди широкого ассортимента средств защиты растений безопасных для человека пестицидов новых поколений. Источники информации 1. Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ. Инструкция 1.1.11-12-35-2004. 2. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. - М. Медицина, 1971. 3. Беленький М.Б. Количественные элементы фармакологического анализа. - Рига Изд. АН Лат., 1969. 4. Владимиров В.Г., Сергиенко В.И. Острый панкреатит. Экспериментально-клинические исследования. - М., 1986. 5. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н., Герловский Д.О., Рубинов Д.Б., Желдакова Т.А. Влияние граминицидов на активность панкреатической фосфолипазы А 2 // Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус Сер.хм.навук. - 2007. - . 82-87. 6. Белан С.Р., Грапов А.Ф., Мельникова Г.М. Новые пестициды Справочник. - М., 2001. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8