Способ оценки степени воздействия ацетата свинца или сульфата цинка на мембрану эритроцитов человека

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ВОЗДЕЙСТВИЯ АЦЕТАТА СВИНЦА ИЛИ СУЛЬФАТА ЦИНКА НА МЕМБРАНУ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Филимоненко Дмитрий Сергеевич Хайруллина Альфия Ягфаровна Ясинский Валерий Маркович Слобожанина Екатерина Ивановна Козлова Наталья Михайловна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(56) СЛОБОЖАНИНА Е.И. и др. Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии.Международный семинар Сб. докладов.- Минск,2006.- С. 158-161..., 2007.- . 70.- . 912-917..., 2003.- . 6 101-105.(57) Способ оценки степени воздействия ацетата свинца или сульфата цинка на мембрану эритроцитов человека, включающий инкубацию выделенных эритроцитов с ацетатом свинца или сульфатом цинка, проведение атомно-силовой микроскопии и построение вертикальных профилей сечения поверхности мембраны эритроцитов, подвергнутых и не подвергнутых воздействию указанной соли, отличающийся тем, что для построенных профилей сечения мембраны указанных эритроцитов рассчитывают длины корреляций нормированных автокорреляционных функций шероховатости, по которым устанавливают степень воздействия соли на мембрану эритроцитов человека. Изобретение относится к области биомедицины, а именно к лабораторным методам исследования, в частности к определению концентрации тяжелых металлов (цинка и свинца) в эритроцитах человека с помощью атомно-силовой микроскопии, и может найти широкое применение при диагностике заболеваний, связанных с воздействием упомянутых нами металлов, а также других воздействий (радиации, лазеров, радиоизлучения и т.д.) на ранней стадии до клинических проявлений заболевания. 13764 1 2010.10.30 Известен способ индикации механического воздействия на мембрану эритроцитов по изменению степени шероховатости эритроцитарных мембран, визуализированных с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), где для описания меры шероховатости поверхности использовалась лишь грубая качественная оценка - визуальная оценка двухмерного изображения непосредственно наблюдателем, которая несет в себе массу ограничений и неточностей,,.//. - 2003. - . 6. - . 101-105. Ближайшим техническим решением к предлагаемому (прототипом) является способ идентификации металлоиндуцированных изменений мембраны эритроцитов человека с помощью атомно-силового микроскопа Слобожанина Е.И., Козлова Н.М., Ясинский В.М.,Филимоненко Д.С., Хайруллина А.Я. Исследование -индуцированных изменений в эритроцитарных мембранах методом атомно-силовой микроскопии. Методические аспекты сканирующей зондовой микроскопии.Международный семинар Сб. докладов.Минск, 2006.- С. 158-161. Задачей изобретения является повышение достоверности оценки степени воздействия токсичных металлов (свинца и цинка) на эритроциты крови человека по шероховатости тонкой структуры участков мембраны эритроцитов с нанометровым разрешением. Поставленная техническая задача решается тем, что в способе оценки степени воздействия ацетата свинца или сульфата цинка на мембрану эритроцитов человека, включающем инкубацию выделенных эритроцитов с ацетатом свинца или сульфатом цинка,проведение атомно-силовой микроскопии и построение вертикальных профилей поверхности мембраны эритроцитов, подвергнутых и не подвергнутых воздействию указанной соли, для построения профиля сечения мембраны указанных эритроцитов рассчитывают длины корреляций нормированных автокорреляционных функций шероховатости, по которым устанавливают степень воздействия соли на мембрану эритроцитов человека. Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими чертежами, где на фиг. 1 слева показано двухмерное АСМ-изображение топографии отсканированной поверхности мембраны эритроцита, находящаяся справа от основного изображения цветовая шкала соответствует распределению цветов при отображении точек поверхности по высоте (от минимальной высоты до максимальной) на фиг. 2 показан типичный профиль шероховатости поверхности мембраны эритроцита (определяется по вертикали относительно двухмерного изображения клетки в плоскости), которому соответствует темная линия на двумерном АСМ-изображении топографии на фиг. 3 изображены нормированные автокорреляционные функции профилей шероховатости немодифицированных эритроцитов , эритроцитов, модифицированных ионами свинцана фиг. 4 изображены нормированные автокорреляционные функции профилей шероховатости немодифицированных эритроцитов , эритроцитов, модифицированных ионами цинкана фиг. 5 показана концентрационная зависимость длины корреляции профиля шероховатостей для эритроцитов, модифицированных ионами свинца , где- корреляционная длина,- концентрация свинца вна фиг. 6 показана концентрационная зависимость длины корреляции профиля шероховатостей для эритроцитов, модифицированных ионами цинка , где- корреляционная длина,- концентрация цинка в . Реализация предлагаемого способа осуществляется следующим образом. Берут кровь здоровых доноров в консерванте глюгицир, полученную в Научно-практическом центре гематологии и трансфузиологии крови. Отделяют эритроциты от плазмы путем центрифугирования крови при 3000 , 15 мин, затем трижды отмывают в 155 мМ/л растворе 2 13764 1 2010.10.30 либо в 5 мМ/л -фосфатном буфере, содержащем 150 мМ( 7,4). Проводят инкубацию эритроцитов (10 -ный гематокрит) с различными концентрациями ацетата свинца. Для исследования эритроцитов методом атомно-силовой микроскопии (АСМисследования) суспензию эритроцитов (20 -ный гематокрит), подвергшуюся воздействию ионов цинка и свинца и без воздействия, фиксируют 2 -ным глутаровым альдегидом, затем инкубируют 2 ч при комнатной температуре, разводят дистиллированной водой до 10 гематокрита и дважды отмывают в дистиллированной воде. Полученную суспензию эритроцитов (5-10 мкл) и мембран эритроцитов наносят на предметное стекло и сушат на воздухе. При помощи атомно-силового микроскопа-206 с использованием стандартных кремниевых зондов(латеральное разрешение составляет 20-30 нм,вертикальное - 0,5 нм) в статическом (зонды 21) либо динамическом (зонды 21) режиме получают АСМ-изображение топографии эритроцита. На полученном двухмерном АСМ-изображении эритроцита выбирают сечение (темная линия на фиг. 1) в той части эритроцита, где нет значительного перепада высот, обусловленного его двояковогнутой формой. Строят профиль сечения в вертикальной плоскости, который дает информацию о величине шероховатости соответственно в каждой из точек сечения. По значениям величины шероховатости в этих точках рассчитывают нормированную автокорреляционную функцию 0 выбранного профиля шероховатостей по формуле (1). По формуле (2) определяют длину корреляции нормированной автокорреляционной функции- среднее значение величины шероховатости(2) Под длиной корреляции нормированной автокорреляционной функции понимается значение(гденаходят на основании формулы (2), а- расстояние между соседними точками в нанометрах), при котором автокорреляционная функция уменьшается в е раз. Характер автокорреляционных функций таков, что при увеличении концентраций как ацетата свинца, так и 4 увеличивается и длина корреляции для соответствующих корреляционных функций. Это связано со сглаживанием шероховатостей на поверхности мембран эритроцитов после воздействия ионов цинка и свинца. Определив длину корреляции для эритроцитов, не подвергнутых воздействию токсичных металлов, и сравнивая ее с длиной корреляции эритроцитов, подвергнутых воздействию свинца и цинка, устанавливают степень металлоиндуцированных изменений,вызванных различными концентрациями этих металлов. Следует заметить, что такие статистические показатели, как средняя величина шероховатости клеток и среднеквадратичное отклонение, недостаточно информативны в каче 3 13764 1 2010.10.30 стве индикатора воздействия токсичных металлов, так как они представляют собой интегральные величины и определяются не только изменениями поверхностной структуры клетки, но и изменениями ее размеров и формы. Следовательно, не представляется возможным поставить в строгое соответствие концентрации токсичных металлов среднюю величину шероховатости поверхностей клеток. В таблице представлены длины корреляции, среднеквадратичные отклонения и средние значения шероховатости профилей сечений эритроцитов с различными концентрациями токсичных металлов, которые позволяют сделать вывод о более достоверном описании степени воздействия цинка и свинца на эритроциты с помощью длины корреляции. Как видно из таблицы, при увеличении концентрации металлов происходит постепенное увеличение длины корреляции, что касается среднеквадратичного отклонения и среднего значения шероховатости, то они менее информативны, и их поведение не позволяет нам сделать однозначных выводов о наличии ярко выраженной взаимосвязи с концентрацией токсичных металлов. Концентрация металлоДлина корреляции,содержащих соединений нм в образце контрольный 146 Таким образом, длина корреляции нормированной автокорреляционной функции позволит более точно характеризовать степень воздействия токсичных металлов (свинца и цинка) на эритроциты человека по шероховатости мембраны эритроцитов. Применение предлагаемого способа позволяет диагностировать степень воздействия токсичных металлов на организм человека на более ранней стадии, до того как произойдет клиническое проявление отравления, благодаря повышению достоверности оценки степени воздействия токсичных металлов (свинца и цинка) на эритроциты крови человека. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5