Способ предварительной оценки безопасности гербицида для животных и человека

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ ГЕРБИЦИДА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Лахвич Федор Адамович Кучуро Светлана Викторовна Герловский Денис Олегович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) ЛИТВИНКО Н.М. и др. // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наук. - 2007.3. - С. 82-87.18584 , 2006.1165989 , 1985.6810371 1, 2004. ЛИТВИНКО Н.М. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. Т. 35. -4. - С. 388-396. ЛИТВИНКО Н.М. и др. // Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия химических наук. - 2008.1. - С. 86-93.(57) Способ предварительной оценки безопасности гербицида для животных и человека на основе моделированияферментативного гидролиза фосфолипидов в виде липосом в присутствии тестируемого гербицида, заключающийся в том, что получают липосомы путем ультразвуковой обработки эмульсии, содержащей 1,3 мМ фосфатидилхолина в трис- буферном растворе, осуществляют преинкубацию в течение 120 минут панкреатической фосфолипазы 2 с тестируемым гербицидом, растворенным в диметилсульфоксиде в количестве 10-100 мкг/мл, проводят реакции гидролиза фосфолипида путем добавления к среде, содержащей липосомы, панкреатической фосфолипазы 2 в количестве 4 мкг/мл в контрольном опыте и такого же количества фермента после его преинкубации с тестируемым гербицидом в тестовом опыте, реакции останавливают до истечения 5 минут добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, экстрагируют продукты реакций смесью хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 21, экстрагент удаляют и осуществляют разделение продуктов реакции с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей хлороформметанолвода, взятых в соотношении 65254, рассчитывают характеризующую уровень активности панкреатической фосфолипазы 2 степень ферментативного гидролиза вкак отношение количества полученных в результате реакции лизопроизводных к сумме фосфатидилхолина и лизопроизводных, и при превышении в тестовом опыте установленного в контрольном опыте уровня активности панкреатической фосфолипазы 2 не более чем на 20 гербицид оценивают как безопасный. 14326 1 2011.04.30 Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины,в частности к способу предварительной оценки безопасности гербицида для животных и человека на основе моделированияферментативного гидролиза фосфолипидов в виде липосом в присутствии тестируемого гербицида, и может быть использовано для предварительного тестирования токсичности новых биологически активных соединений,обладающих гербицидной активностью. Использование химических средств защиты растений (гербицидов) в сельском хозяйстве становится обычной практикой. При этом главным показателем экологической безопасности пестицидов и, в частности, гербицидов считается общая токсичность препарата,определяемая, как правило, на животных, на основании которой рассчитываются допустимые суточные дозы (ДСД) 1, 2. Моделируют острое отравление путем однократного введения препарата в желудок экспериментальных животных при помощи иглы-зонда. В острых опытах каждую дозу испытывают на 6-12 животных с последующим наблюдением в течение 14 суток с учетом характера симптомов интоксикации, количества погибших животных, срока их гибели. Затем определяют общие биохимические показатели - содержание белка в моче, мочевины в крови и моче, гемоглобина, лейкоцитов в периферической крови, активности аланин- и аспартатаминотрансфераз в сыворотке крови, хлоридов в крови и моче, общего холестерина, щелочной фосфатазы, триглицеридов, креатинина,диеновых коньюгатов и кетодиенов и др. С целью гигиенической оценки условий труда при применении средств защиты растений выполняются натурные исследования на опытных участках, где работают с гербицидами. Исследования проводятся в соответствии с Методическими рекомендациями 3, 4. Таким образом, существующие методы определения биобезопасности гербицидов при возможном попадании в организм в остаточных количествах с пищей или при работе с ними трудоемки, требуют больших затрат экспериментальных животных (мышей, крыс,кроликов), времени, а также специальных многоступенчатых исследований и реактивов,что создает большие трудности при необходимости быстрого определения уровня токсичности применяемых в растениеводстве современных средств защиты растений. В то же время фосфолипазы 2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА 2), обладая способностью к избирательному и типичному воздействию на фосфолипиды, могут быть использованы для контролируемого разрушения биологической мембраны (фосфолиполиз) и стать индикатором для оценки неблагоприятного воздействия гербицидов на клеточные стенки, моделью которых будут служить липосомы - концентрические фосфолипидные бислои, что позволяет с высокой точностью охарактеризовать степень биобезопасности гербицидов, не используя лабораторных животных (прототип) 5. Метод дал положительный результат, однако оказался узкоприменимым, т.к. определение воздействия гербицидов по скорости гидролиза липосом указывало только на увеличение деградации модельных липидных мембран в начальный период времени и нивелирование его к моменту насыщения фермента субстратом, но не давало возможности различить особенности действия разных гербицидов и механизм взаимодействия с гербицидами на разных стадиях липолиза, знание которого необходимо для нахождения адекватных методов борьбы при возможном отравлении гербицидами. Задачей настоящего изобретения является разработка способа предварительной оценки безопасности гербицида для животных и человека на основе моделированияферментативного гидролиза фосфолипидов в виде липосом в присутствии тестируемого гербицида, позволяющего установить особенности его действия на организм человека или животного для нахождения адекватных методов борьбы при возможном отравлении гербицидами. Поставленная задача решается способом предварительной оценки безопасности гербицида для животных и человека на основе моделированияферментативного гидролиза фосфолипидов в виде липосом в присутствии тестируемого гербицида, заключающимся в 2 14326 1 2011.04.30 том, что получают липосомы путем ультразвуковой обработки эмульсии, содержащей 1,3 мМ фосфатидилхолина в трис- буферном растворе, осуществляют преинкубацию в течение 120 минут панкреатической фосфолипазы 2 с тестируемым гербицидом, растворенным в диметилсульфоксиде в количестве 10-100 мкг/мл, проводят реакции гидолиза фосфолипида путем добавления к среде, содержащей липосомы, панкреатической фосфолипазы 2 в количестве 4 мкг/мл в контрольном опыте и такого же количества фермента после его преинкубации с тестируемым гербицидом в тестовом опыте, реакции останавливают до истечения 5 минут добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, экстрагируют продукты реакций смесью хлороформа и метанола, взятых в объемном соотношении 21, экстрагент удаляют и осуществляют разделение продуктов реакции с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей хлороформметанолвода, взятых в соотношении 65254, рассчитывают характеризующую уровень активности панкреатической фосфолипазы 2 степень ферментативного гидролиза вкак отношение количества полученных в результате реакции лизопроизводных к сумме фосфатидилхолина и лизопроизводных и при превышении в тестовом опыте установленного в контрольном опыте уровня активности панкреатической фосфолипазы 2 не более чем на 20 гербицид оценивают как безопасный (фиг. 2). Заявляемый способ позволяет использовать 10-100 мкг пестицида для определения его безопасности (фиг. 2). Таким образом, заявленный способ на небольшом количестве доступного сырья без использования лабораторных животных позволяет по величине относительной степени гидролиза липосом как модели клеточной мембраны провести измерение активности ФЛА 2 в сравнении с контрольной величиной как индикатора разрушения клеточных стенок при пищеварении в присутствии тестируемого пестицида и без него и обеспечивает достижение результата с большей эффективностью, чем в способе-прототипе, где характеристика активности ФЛА 2 определяется только по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продуктабез соотнесения с контрольной величиной, что не позволяет в достаточной степени оценить пределы относительной безопасности исследуемого вещества. На фиг. 1 представлена относительная степень гидролиза липосом из ФХ в присутствии и в отсутствии исследуемых соединений. На фиг. 2 представлена зависимость доза-эффект соединенияна относительный гидролиз липосом под действием ФЛА 2 и показаны пределы чувствительности заявляемого способа. Приведенные ниже примеры определения активности ФЛА 2 с использованием липосом подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1 Определение влияния гербицида 5-(2,4,6-триметилфенил)-2-(1-этоксииминопропил)циклогексан-1,3-диона (тралкоксидим, соединение ) - действующего вещества пестицида Грасп - на липолитические реакции в ламеллярной фазе (липосомы) с участием ФЛА 2. Для получения липосом из фосфатидилхолина хлороформ, в котором растворен фосфолипид, выпаривают на роторном испарителе. Остатки растворителя удаляют в течение 30 мин с помощью вакуумного насоса. К образовавшейся фосфолипидной пленке добавляют 0,05 М трис- буферного раствора 7,4 до получения конечной концентрации субстрата 1,3 мМ. Полученную эмульсию обрабатывают ультразвуком 5 раз по 0,5 мин с перерывом в 1 мин с помощью УЗДН-2 Т (22 к, 20 ). Эффекторы (соединения -,фиг. 1) растворяют в диметилсульфоксиде (100 мкг/мл). Фермент преинкубируют с эффекторами в течение 120 мин. Реакционная смесь содержит субстрат 1,3 мкмоль, 2 мМ СаС 12 и 0,05 трис-,7,4. Реакцию гидролиза липосом из фосфатидилхолина начинают добавлением в среду инкубации при 37 С раствора ФЛА 2 (4 мкг/мл) после преинкубации с соединениями -, останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ. Продукты ферментативной реакции из реакционной среды экстрагируют двумя объемами 3 14326 1 2011.04.30 смеси хлороформ/метанол 21 (по объему). Нижний слой отделяют, растворитель выпаривают и продукты реакции анализируют с помощьюна силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65254. Пластины проявляют реагентом на фосфолипиды 6, пятна фосфолипида и их лизопроизводных вырезают и анализируют в них содержание фосфора по методу, описанному в работе 6. Активность ФЛА 2 характеризуют по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта . Скорость реакции выражают в количестве образованного продукта (мкмоль) в мин на мг белка. В работе используют коммерческий препарат ФЛА 2 поджелудочной железы свиньи (фирмы ). Пример 2 В условиях примера 1 проводят исследование 2-пропаноил-5-(2,4,6-триметилфенил)циклогексан-1,3-диона - предшественника в химическом синтезе тралкоксидима (соединение ). В таблице представлена кинетическая характеристика гидролиза ФХ в ламеллярной фазе под действием ФЛА 2 в отсутствии (контроль) и в присутствии соединенийи . Как следует из представленных данных, обнаружено инициирующее действие соединений ,на начальном этапе реакции от 2 до 5 мин активность фермента при гидролизе панкреатической ФЛА 2 липосом из ФХ в присутствии тралкоксидима и его предшественника в химическом синтезе увеличивается в 1,1-1,5 раза. Кинетическая характеристика гидролиза ФХ в ламеллярной фазе под действием ФЛА 2 в отсутствии (контроль) и в присутствии соединенийиКонтроль СоединениеСоединение, мкмольмин-1 мг-1 , мкмольмин-1 мг-1 2 7,70,5 8,40,3 7,50,6 5 2,50,8 3,90,02 3,50,07 10 2,30,03 2,40,13 1,90,004 На фиг. 1 представлено изменение во времени относительной степени гидролиза (фактическая степень гидролиза в определенный момент времени к степени гидролиза в начале реакции - до 2 мин) ФЛА 2 субстрата в ламеллярной фазе в отсутствии (К) и в присутствии соединенийи . На графике зависимости от времени относительной степени ферментативного гидролиза субстрата в реакции без эффекторов четко выражен лаг-период (до 5 мин), после которого кривая стремится вверх. В присутствии испытуемых соединений лаг-период отсутствует, что свидетельствует об улучшении связывания фермента с субстратом в начальный период времени. Однако в период реакции от 6 до 10 мин активность фермента в опыте по сравнению с контролем снижается. Тралкоксидим через 10 мин подавляет активность ФЛА 2 в 1,3 раза. Причем в присутствии соединениянасыщение фермента субстратом происходит раньше, чем в присутствии соединения , поскольку относительная степень гидролиза субстрата в период с 5 до 10 мин снижается, а во втором случае продолжает увеличиваться. Отсутствие к этому времени выраженного насыщения фермента субстратом в присутствии соединенияпредполагает различные механизмы взаимодействия эффекторов с ферментом на разных стадиях липолиза (начальном и в период насыщения фермента субстратом). На фиг. 2 показана зависимость доза-эффект для соединения , которая показывает высокую чувствительность заявляемого способа - возможность определять исследуемый пестицид в количестве от 10 мкг с высокой точностью. Подавление активности фермента под действием соединенияот 20 и ниже, как следует из кривой на фиг. 2, наблюдается при количестве исследуемых веществ от 200 мкг,что соответствует превышению допустимой дозы (ДСД 0,002 мг/кг массы тела человека 4 14326 1 2011.04.30 7) в 2 раза и выше. Следовательно, пестицид может считаться биобезопасным при условии изменения активности ФЛА 2 в среднем на 20 . Таким образом, на примере известных гербицидов установлено, что использованиефосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипидов липосом как модели клеточной мембраны позволяет достоверно оценивать безопасность пестицида для организма животных и человека. Разработанный экспрессметод имеет явные преимущества, поскольку не требует длительных испытаний на лабораторных животных и создает благоприятные условия для определения среди широкого ассортимента средств защиты растений безопасных для человека пестицидов новых поколений. Источники информации 1. Инструкция 1.1.11-12-35-2004. Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ. 2. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. - М. Медицина, 1971. 3. Метод оценки риска воздействия гербицидов на работающих 201/73, утв. Зам. Министра здравоохранения РФ Онищенко Г.Г. 16.04.2001. 4. Методические указания по гигиенической оценке новых гербицидов. - Киев, 1988.4263-87. 5. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рубинов Д.Б., Герловский Д.О. Биоиндикация экологической безопасности гербицидов новых поколений на основе фосфолиполитической реакции 7-я межд. науч. конф. Сахаровские чтения 2007 года экологические проблемывека, 17-18 мая 2007 года. - Минск Беларусь. - С. 102-103. 6.//. . 1975. - . 114. -1. - . 129-141. 7. Белан С.Р., Грапов А.Ф., Мельникова Г.М. Новые пестициды Справочник. - М.,2001. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5