Способ наращивания возбудителя рака картофеля – гриба Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc.

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ НАРАЩИВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ РАКА КАРТОФЕЛЯ ГРИБА(.) .(71) Заявитель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений(72) Авторы Жукова Мария Ивановна Середа Галина Михайловна Иванчук Наталья Николаевна Зубкевич Ольга Николаевна Халаева Валентина Иосифовна(73) Патентообладатель Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений(56) Методические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость. - Ленинград, 1982. - С. 8-23. ХЮТТИ А.В. и др. Збрник наукових праць СГ. - 2009. - Вип. 13. -53. С. 107-113. СЕРЕДА Г.М. и др. Защита растений. Сборник научных трудов. Вып. 32. Несвиж, 2008. - С. 245-255. Методические указания по оценке устойчивости льна к фузариозному увяданию, антракнозу и пасмо. Оценка сортов и гибридов картофеля на устойчивость к раку и глободерозу на совмещенных и раздельных фонах. Минск, 2001. - С. 14-15, 18-21. ЗЕЛЯ А.Г. Стйксть картопл проти збудника раку ((.) .), методи його виявленнядиференцац Автореф. дис. Кив, 2009. - С. 5-6.(57) 1. Способ наращивания возбудителя рака картофеля - гриба(.) ., заключающийся в том, что перед посадкой клубень картофеля выдерживают в течение 30 мин в 0,05 -ном растворе эпина, после чего обрабатывают его верхушечные ростки 0,5-0,7 г порошка, представляющего собой зооспорангии гриба(.) ., выращивают картофель из клубня до уборки при температуре почвы не менее 18,0 С и ее увлажнении до 80-90 от полной влагоемкости и собирают раковые опухоли, содержащие возбудитель рака картофеля - гриб(.) . - с прикорневой зоны стебля картофеля и молодых клубней. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что температуру почвы не менее 18,0 С поддерживают путем мульчирования. Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при испытании новых сортов картофеля на ракоустойчивость. Рак картофеля вызывает гриб .(.) ., который на территории республики Беларусь относится к числу карантинных объектов. К настоящему времени природные очаги рака немногочисленны, встречаются только на приусадебных участках. 18462 1 2014.08.30 Внедрение в производство сортов картофеля, устойчивых к раку (патотип 1 1), согласуется с мировой практикой обязательной оценки селекционного материала на ракоустойчивость к облигатному паразиту. В предыдущие годы запас инфекции пополнялся за счет сбора наростов гриба в очагах поражения в ходе проведения ежегодных маршрутных обследований. В настоящее время в связи с резким сокращением количества раковых очагов в полях севооборота и строго обязательным свойством ракоустойчивости сорта при включении в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь такая возможность получения ценного биологического материала весьма ограничена. Для ежегодного проведения оценки селекционного материала картофеля на ракоустойчивость необходимо не менее 10 кг сухих раковых наростов, что требует получения достаточного количества заразного начала в виде инфекционного порошка для реализации селекционных программ в условияхи. Основная задача наших исследований заключалась в оптимизации способов наращивания инфекции гриба(.) . для формирования инфекционных фонов при оценке на ракоустойчивость картофеля. Выбор задачи основывался на гипотезе, что под влиянием активных соединений интенсифицируются в растениях обменные процессы, меняется направленность биохимических реакций, что приводит к подъему уровня их жизнедеятельности и повышению продуктивности больных растений с увеличением размеров раковых наростов 1. Согласно разработанным методическим указаниям, оценка сортов и гибридов картофеля в селекционном процессе на устойчивость к грибу проводится два года в предварительном и один год в государственном испытании. При испытании на ракоустойчивость в лабораторных условиях известны способы оценки 2 методом заражения ростков от свежих раковых наростов, содержащих быстро прорастающие летние зооспорангии, требующие для заражения кусочки свежих раковых наростов размером не менее 1-1,5 см на клубень. Имеются данные о получении раковой инфекции способом заражения восприимчивого сорта Вольтман сухим зооспорангиевым порошком гриба (из расчета 1-1,5 г на клубень), а также использованием инфекционного компоста из расчета 100 г зооспорангиевого порошка на 6 кг почвы, содержащего не менее 12000 шт. живых зооспорангиев гриба/г почвы. Известен способ прямого заражения клубней восприимчивого сорта инфекцией возбудителя обработанной соединениями, что предусматривает выдерживание зооспорангиевого порошка при комнатной температуре в течение 6 сут. в растворах препаратов с последующим заражением ростков клубней картофеля 0,1-0,3 см этой массой 3. С практической точки зрения наиболее опасной стадией развития гриба .являются зимние (покоящиеся) зооспорангии, которые длительное время сохраняются в почве, обладая высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Однако при наличии определенных условий и благоприятных факторов среды важным остается свойство паразита прорастать в фазе покоящихся зооспорангиев в отсутствии растения-хозяина и гибнуть, когда нет соответствующего питательного субстрата, или усиленно развиваться и формировать симптомы заболевания у восприимчивого сорта. Существует мнение многих ведущих ученых в этой области, что воздействие на спорангии и их прорастание возможно также под влиянием биологически активных препаратов или химических соединений. Информационный поиск сведений о наличии таких соединений показал, что прорастание зимних спорангиев возбудителя рака картофеля значительно стимулируется веществами типа биос, которые содержатся в корневых выделениях некоторых растений,органических соединениях в виде навоза, птичьего помета и др., а также минеральных удобрений. Именно эту особенность прорастания покоящихся спорангиев гриба при нали 2 18462 1 2014.08.30 чии таких веществ подчеркивали ученые Н.А. Дорожкин, Шариков 4 С.В. Горленко 5 из Минской научно-исследовательской станции по раку картофеля Л.П. Салтыкова 6 из Всесоюзной научно-исследовательской станции по раку картофеля в Ленинграде М.И.Данченко 7 из Белорусского научно-исследовательского института защиты растений. Значительно стимулирующий эффект для прорастания зооспорангиев был отмечен в результате применения раствора анейрина, одного из компонентов биоса (витамин В 6) в концентрации от 0,000002 до 0,01 . В таком растворе (0,01 ) за 2 месяца прорастало 99,08 , в то время как в контроле (вода) 56,468. Эффективность влияния таких веществ в патогенезе гриба в виде органических и минеральных биологических соединений отмечали из Всесоюзной научно-исследовательской станции по раку картофеля в Ленинграде Д.Б. Розенберг 9 П.Р. Лейцис 10 Д.В. Липсиц 11 и П.О. Мельник 12 из научно-исследовательской станции карантина растений Украины. Они могут усиливать патогенез гриба в том случае, если способствуют повышению содержания аминокислот, благоприятных для развития патогена, при этом данные, полученные Н.А Дорожкиным, С.В Горленко в 13 дополняли, что одним из факторов, влияющим на ускоренное прорастание покоящихся зооспорангиев возбудителя рака, является внесение органических удобрений в виде коровьего навоза в норме 20 т/га и,в большей степени, птичьего помета - до 5 т/га. Известны данные Липсица Д.В. (1964) из Всесоюзной научно-исследовательской станции по раку картофеля в Ленинграде об эффективности внесения в почву борной кислоты в норме 5 кг/га и опрыскивании растений 0,1 -ным раствором в очагах инфекции в фазе пятого листа и начале цветения. Образование раковой опухоли у зараженных растений возрастало более чем в 1,5-2 раза. Однако одним из спорных вопросов применения биологически активных соединений в селекционном процессе на ракоустойчивость остается разработка способов их активного воздействия на возбудителя, при этом важна целесообразность применения не только самих приемов, но и последовательность их применения в различных комбинациях, на что указывали еще исследования, проведенные Розенбергом Д.Б (1957), Лейцис П.Р., (1957),Липсицом Д.В. (1964) и др. Таким образом, наиболее близким к заявляемому в качестве соединения, усиливающего паразитическую активность гриба в почве в условиях, является использование растворов анейрина (витамин В 6), одного из компонентов веществ типа биос в концентрации от 0,000002 до 0,01 , выполненная на базе Института социалистического сельского хозяйства АН БССР в 1957 г. Основным условием применения данного соединения является возможность искусственного воздействия на процессы дозревания, вызывая усиленное прорастание зооспорангиев гриба . . Разработанные ранее приемы внесения в почву таких веществ, стимулирующих прорастание зооспорангиев при условии отсутствия растения-хозяина, были направлены прежде всего на очищение почвы от возбудителя заболевания. Поставленная задача решается тем, что предложен способ наращивания инфекции гриба(.) . в селекционном процессе картофеля на ракоустойчивость, включающий применение биологически активных веществ, приготовление водного раствора препарата, приготовление инфекционного порошка и обработку клубней картофеля перед посадкой с использованием в качестве биологически активного вещества 0,05 -ного раствора эпина из группы эпибрасси-нолидов с нормой расхода 200 мкл/л путем смачивания (окунания) и выдерживания (экспозиции) клубней в изолированной емкости в течение 30 мин с последующим заражением их зооспорангиевым порошком гриба из расчета 0,5-0,7 г на верхушечные ростки клубня. При пониженной температуре почвы (менее 18,0 С) в период активного роста культуры проводят ее мульчирование, а в условиях засушливого вегетационного периода осуществляют дополни 3 18462 1 2014.08.30 тельное увлажнение почвы до оптимального уровня, составляющего 80-90 от полной влагоемкости. Сущность изобретения подтверждается следующим примером. На основании теоретических данных в лаборатории защиты картофеля проведен скрининг и подобран ассортимент зарегистрированных и рекомендуемых для применения в качестве регуляторов роста растений биологически активных соединений (на основе переработки отходов растительного сырья и торфа мальтамин, гидрогумат, сфагнин), регулятора роста из класса природных фитогормонов - брассиностероидов эпина, а также эмистима, составляющего комплекс природных ростовых веществ, аминокислот и микроэлементов и янтарной кислоты, представляющих интерес для испытания их эффективности в качестве индукторов накопления биологической массы гриба . . В условиях лизиметров в 2006-2009 гг. на восприимчивом к раку сорте (Вольтман) картофеля была заложена серия опытов по изучению эффективности различных соединений в индукции наростов при формировании инфекционного фона гриба как в почве, так и методом заражения клубневого материала сухим зооспорангиевым порошком. Регулятор роста эпин создан на основе действующего вещества 24-эпибрассинолида и относится к открытому в 1970 г. классу природных фитогормонов - брассиностероидов 14. Благодаря своему механизму действия и выраженной фитогормональной активности соединение способно усиливать паразитическую активность гриба у клубней восприимчивого сорта, вызывая некоторое увеличение числа растений, носителей раковой инфекции, и выступать вместе с тем в качестве стимулятора образования раковой опухоли. Для получения достоверной оценки эффективности эпина в качестве регулятора роста в лизиметрах нами был предложен способ окунания клубней в раствор препарата различных концентраций (экспозиция 0,5 ч) перед посадкой клубней селекционных гибридов с последующим заражением их зооспорангиевым порошком из расчета 0,5-0,7 г на верхушечные ростки клубня с расходом рабочей жидкости 50 мл на 20 клубней в ряд. Опыт был заложен по методике предварительного испытания на ракоустойчивость. В целях рационального применения эпина в условияхна инфекционном фоне гриба рассматривался также вопрос целесообразности использования его способом опрыскивания растений во время вегетации раствором препарата в фазу начала всходов (5-10 см) растений. Проведенные исследования показали, что применение эпина в различных концентрациях при проникновении его внутрь растительной ткани клубня и листьев может влиять на характер патологического процесса. Степень воздействия эпина на развитие облигатного паразита определялась различной реакцией ростков клубней на заражение, создавая условия для усиления паразитической активности возбудителя рака. Эффективность действия препарата на патогенез гриба у инфицированных растений рассматривалась также и с точки зрения влияния его на образование величины наростов и накопления соответственно биологической массы раковой опухоли на прикорневой зоне стебля и молодых клубнях. Наиболее активное нарастание биомассы нароста на каждый зараженный куст по отношению к контролю отмечено при применении регулятора роста в норме расхода 200 мкл/л в 2006 г. - на 5,6 г, в 2007 г. - на 8,7 г, 2009 г. - на 4,3 г, что в среднем за 20062009 гг. выразилось в увеличении массы наростов в 2,96 раза или на 4,5 г на зараженный куст с превышением контроля на 66,2 , обеспечивая преимущество заявляемого способа наращивания инфекции паразита (табл. 1). 18462 1 2014.08.30 Таблица 1 Пораженность растений раком к моменту уборки при предпосадочной обработке клубней эпином (карантинный стационар, сорт Вольтман) Масса наростов Норма Вариант расхода,г/зараженный кустк контролю мкл/л 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г. среднее раз г(обработка 0,5 2,1 1,8 4,7 2,3 водой) Нарастание дополнительной биомассы нароста по отношению к максимальному значению в контроле составило в 2006 г. - 9,2 г, 2007 г. - 32,4 г, в 2008 г. - 3,0 г, 2009 г - 10,9 г. Выявленное свойство эпина характеризует его как соединение, способствующее увеличению размера ракового нароста в среднем с одного куста (табл. 2). Таблица 2 Стимулирующая активность регулятора роста эпина на образование раковых наростов картофеля при предпосадочной обработке клубней(карантинный стационар, сорт Вольтман) Нарастание величины раковой опухоли (-), г Вариант 2006 г. 2007 г. 2008 г. 2009 г. Эпин 0,16-10,8 0,17- 39,9 0,16-4,9 0,98-20,3 Контроль (вода) 0,02-1,7 0,05-7,5 0,15-1,9 0,17-9,36 Вместе с тем, при анализе инфекционного порошка из раковых наростов, полученных при обработке клубней эпином, установлена возможность формирования значительно большего количества жизнеспособных зооспорангиев в сравнении с установленным уровнем в контроле. Приоритет изобретения заключается в повышении под действием эпина уровня жизнеспособных, имеющих главенствующее значение для инфекционного процесса зооспорангиев - на 3000 шт./г инфекционного порошка или на 46,9 выше, чем в контроле (табл. 3). Таблица 3 Роль эпина в формировании инфекционной способности грибаКоличество жизнеспособных зооспорангиев Вариантк контролю шт./г инфекционного порошка Эпин 9400 146,9 3000 46,9 Контроль (вода) 6400 100,0 Способ наращивания инфекционного материала гриба с применением эпина посредством предпосадочной обработки клубней для испытания селекционных образцов картофеля путем заражения посадочных клубней зооспорангиевым порошком позволяет сократить затраты в 3,5 раза в пересчете на 1000 испытываемых образцов (табл. 3). Для обеспечения задействованных в патосистеме организмов (восприимчивое растение-хозяин - гриб(.) .) факторов, соответствующих уровню нормального их функционирования при взаимодействии друг с другом, возможно и при пониженной температуре почвы (2006 г.), что предполагает ее мульчирование для повышения температурного режима. В условиях засушливого вегетационного периода осуществляют полив почвы для повышения ее влагообеспеченности, что подтверждает реализацию заявленного способа наращивания инфекции гриба .в любой посевной год. 18462 1 2014.08.30 На фигуре представлены оптимальлные гидротермические режимы для развития рака,растений картофеля и вариабельность погодных условий по годам в период интенсивного роста клубней (по данным агрометеологической станции, карантинный стационар, Прилуки, июль 2006-2009 гг.). Реализация задания позволит оптимизировать способы наращивания инфекции гриба(.) . с повышением его паразитической активности в почве и агрессивных свойств, что является основой усовершенствованных методических рекомендации по формированию инфекционных фонов рака картофеля. Предлагаемый способ позволяет существенно повысить достоверность оценки картофеля на ракоустойчивость при относительно низкой ресурсоемкости данного процесса. Источники информации 1. Юхневич М.И. и др. Влияние биологически активных препаратов на продуктивность и качественные показатели картофеля // Сб. науч. тр./РУП Ин-т картофелеводства НАН Беларуси. - Минск, 2000. - Вып. 10. Картофелеводство. - С. 242-248. 2. Яковлева В.А. и Салтыкова Л.П. Лабораторная диагностика ракоустойчивости методом заражения ростков от свежих раковых наростов Методические указания / ВНИИ защиты растений. - М., 1979. - 8 с. 3. Салтыкова Л.П. Рак картофеля в Чехословакии // Тр. ВНИИ защиты растений. - Л.,1973. - Вып. 36. - С. 12-11. 4. Дорожкин Н.А. Шариков К.Е. О биологии рака картофеля и способы борьбы с ним// Сб. тр./Ин-т биологии АН БССР. - Минск, 1951. - Вып. 2. - С. 3-12. 5. Горленко С.В. Севооборот и органические удобрения в борьбе с картофельным раком // Сб. тр. Ин-та соц. сел. хоз-ва АН БССР. - Минск, 1955. - Вып. 3. 6. Салтыкова Л.П. О сортовых различиях картофеля по устойчивости к обычной и агрессивным расам возбудителям рака //Тр. ВНИИ защиты растений. - Л., 1973. - Вып. 36. С. 43-62. 7. Данченко М.И. Биологические особенности возбудителя рака картофеля в связи с подбором исходных форм при выведении ракоустойчивых сортов картофеля Автореф. дис.канд. с.-х. наук. Белорус, науч.-исслед. ин-т картофелеводства и плодоовощеводства. - Самохваловичи. Минская обл., 1978. - 22 с. 8. Горленко С.В., Дорожкин Н.А. Биология возбудителя рака картофеля // Рак картофеля. - Киев, 1957. - С. 17-26. 9. Розенберг Д.Б., Химические вещества и препараты для борьбы против рака картофеля. Рак картофеля. - Киев, 1957. - С. 114-121. 10. Лейцис П.Р. Динамика в почве хлорпикрина, внесенного для обеззараживания ее от возбудителя рака картофеля. Рак картофеля. -Киев, 1957. - С. 122-126. 11. Липсиц Д.В., Биохимия устойчивости картофеля к возбудителю рака(.) . Автореф. дис.докт. биол. наук. Всесоюз. науч.-исслед. станция по раку картофеля. - М., 1964. - 36 с. 12. Мельник П.О., Етологя раку картопл, боекологчне обгрунтування заходв його профлактики та обмеження розвитку Автореф. дис.д-ра бол. наук. Нац. аграр. унверситет. - Кив, 2005. - 35 с. 13. Дорожкин Н.А., Горленко С.В. Агротехнические способы борьбы с картофельным раком. - Минск, 1958. - 40 с. 14. Саскевич П.А., Козлов С.Н., Кажарский В.Р. Результаты испытаний биостимуляторов новосил и растим на льне-долгунце //Земляробстваахова раслн. - 2006. -1. С. 49-51. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7