Способ хранения бактерий Pseudomonas fluorescens

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ХРАНЕНИЯ БАКТЕРИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Рахуба Денис Викторович Новик Галина Ивановна Гречиха Александра Демьяновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ хранения бактерий, отличающийся тем, что бактерии хранят при температуре 70 С, при этом суспензию бактерий с титром 109-1010 КОЕ/мл в питательной среде, содержащей 10 сахарозы, предварительно замораживают при температуре -196 С. Изобретение относится к области микробиологии, криобиологии и биотехнологии, в частности к методам долгосрочного хранения культур микроорганизмов, и может найти применение в работе сервисных и производственных коллекций культур микроорганизмов. Бактерииотносятся к грамотрицательным палочковидным бактериям, принадлежащим семейству . В практике контроля пищевых продуктов они издавна известны как индикаторы зараженности 1. Бактерии данного вида широко используются в качестве модельных объектов для многочисленных исследований. Кроме того, данные бактерии могут использоваться как средство биологического контроля для борьбы с возбудителями болезней животных и человека 2. В Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов на хранении находятся штаммы, являющиеся хозяевами бактериофагов, которые были выделены для нужд сельского хозяйства, и впоследствии на их основе был создан профилактический препарат Пентафаг для защиты культурных растений от фитопатогенных бактерий рода . Все вышеперечисленное обуславливает необходимость разработки надежного метода хранения указанного вида бактерий в течение длительного времени. С целью гарантированного долгосрочного поддержания жизнеспособности культур микроорганизмов в ведущих коллекциях мира (, , ) применяются способы, обеспечивающие хранение культур в метаболически неактивном состоянии. Основными методами являются лиофилизация и криоконсервация с использованием жидкого азота (-196 С) или ультранизких морозильников ( 70 С). Из литературных данных известно, что процесс лиофилизации живых объектов может приводить к повреждению ДНК. Степень летальности подобных повреждений зависит от 17672 1 2013.10.30 наличия у лиофилизируемого объекта специализированных систем репарации данных повреждений 3. Однако даже при наличии подобных систем, восстановление ДНК может проходить с ошибками, что приводит к возникновению мутаций 4, 5. Также было выявлено, что молекулы кислорода способны индуцировать мутации в уже лиофилизированных препаратах при их хранении 6, 7. Криоконсервация при сверхнизких температурах на сегодняшний день является одним из самых передовых методов длительного хранения биологических объектов. При использовании данного метода наблюдается высокий уровень сохранения жизнеспособности, диагностических и хозяйственно-ценных свойств культур различных систематических групп. Наиболее близким по достигаемому результату является способ замораживания бактериальной суспензии до температуры 30 С. В качестве среды консервирования используют питательную среду, содержащую 0,5 мясного экстракта, 1 пептона, 1 дрожжевого экстракта и 10 обезжиренного молока. Концентрация клеток в суспензии составляет 105 КОЕ/мл. Данный метод обеспечивает сохранность клеток на уровне 18-28 непосредственно при замораживании. Потери жизнеспособности клеток при хранении составляют 10 в течение первых суток 8. Низкая выживаемость клеток при замораживании и хранении является существенным недостатком данного метода. Задача данного изобретения заключается в разработке нового метода хранения бактерий вида, обеспечивающего длительное сохранение их жизнеспособности и физиологической стабильности. Поставленная задача достигается за счет использования сверхбыстрого замораживания в жидком азоте при 196 С, добавления в среду консервирования 10 сахарозы и хранения культур в ультранизком морозильнике при 70 С. Данные условия замораживания и хранения были получены при оптимизации технологических параметров криоконсервации, которая включала экспериментально обоснованный подбор оптимальной скорости охлаждения необходимого криопротектора, а также оптимальной температуры хранения. Исследованные параметры суммированы в табл. 1. Таблица 1 Исследуемый параметр Скорость охлаждения Значение параметра медленное охлаждение при -20 С быстрое охлаждение при -70 С сверхбыстрое охлаждение при -196 С 10 глицерол 5 ДМСО 10 сахароза 20 С 70 С 196 С Известно, что одним из повреждающих факторов при криоконсервации бактериальных клеток является гидростатическое давление в замерзающих замкнутых включениях,возникающих внутри кристаллов льда и содержащих клетки микроорганизмов. Величина давления внутри подобных включений может достигать 2103 атм. 9. Избежать данного повреждающего фактора можно при замораживании концентрированных суспензий микроорганизмов. При большом количестве клеток в единице объема включения находятся на небольшом расстоянии друг от друга и между ними возникают трещины, которые препятствуют развитию гидростатического давления 9. Исходя из этих данных, для криоконсервации псевдомонад используют суспензию клеток с высоким титром. Клетки культивируют на поверхности плотных питательных сред в течение суток, после чего смывают порцией свежей питательной среды с добавлением сахарозы в концентрации 10 . Концентрация клеток в суспензии составляет 109-1010 КОЕ/мл. Далее суспензия 2 17672 1 2013.10.30 клеток раскапывается в стерильные криопробирки и замораживается в жидком азоте при 196 С. Хранение замороженных образцов осуществляется в ультранизком морозильнике при 70 С. Культура бактерий после размораживания является физиологически активной и готова к использованию. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. Влияние скорости охлаждения на выживаемость бактерий. Образцы суспензий бактериальных клеток в питательном бульоне охлаждают на ледяной бане до 0 С, после чего замораживают в морозильных камерах при 20 и 70 С, а также в жидком азоте при 196 С. Данные условия замораживания обеспечивают соответственно медленную, быструю и сверхбыструю скорость охлаждения. Через 24 ч образцы оттаивают на водяной бане при 37 С. Титр жизнеспособных клеток определяют стандартным методом предельных разведений с последующим высевом на чашки. В качестве контроля служит суспензия клеток, не подвергавшаяся криоконсервации. В табл. 2 представлены данные о выживаемости бактерий .после замораживания с различными скоростями охлаждения. Таблица 2 Выживаемость бактерий Режим замораживания, С КОЕ/мл(1,230,17)1010 80 Из приведенных данных видно, что сверхбыстрое замораживание суспензии клеток прямым погружением в жидкий азот обеспечивает наилучшую их сохранность. Пример 2. Влияние скорости охлаждения на сохранение физиологической активности культуры бактерий. В качестве критерия, характеризующего физиологическое состояние клеток,была выбрана скорость накопления биомассы. Из литературных данных известно, что физиологическое состояние клеток влияет на взаимодействие бактериофагов с клеткой-хозяином, в частности на такие показатели, как латентный период, скорость адсорбции и количество реплицируемых фагов на одну клетку. Исходя из этого, чувствительность клеток бактерий к фаговой инфекции была выбрана вторым критерием, характеризующим физиологическое состояние бактерий. Образцы суспензий бактериальных клеток в питательном бульоне охлаждают на ледяной бане до 0 С, после чего замораживают в морозильных камерах при 20 и 70 С, а также в жидком азоте при 196 С. Данные условия замораживания обеспечивают соответственно медленную, быструю и сверхбыструю скорость охлаждения. Через 24 ч образцы оттаивают на водяной бане при 37 С. Для изучения скорости накопления биомассы культуры, подвергавшейся криоконсервации, размороженную суспензию клеток вносят в свежую порцию стерильной питательной среды в соотношении 1 мл культуры на 50 мл среды, инкубируют при 28 С при постоянном перемешивании. Каждые 20 мин отбирают равные аликвоты культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность (ОП) при 590 нм. О сохранении физиологической активности судят по скорости накопления биомассы, т.е. по увеличению ОП. В качестве контроля служит суспензия клеток, не подвергавшихся криоконсервации. Представленные на фиг. 1 данные свидетельствуют, что процесс криоконсервирования негативно сказывается на физиологическом состоянии клеток. Во всех вариантах опыта скорость накопления биомассы была значительно снижена в сравнении с контролем. Наилучшим режимом замораживания, при котором лучше всего сохраняется физиологическая активность клеток, является сверхбыстрое охлаждение при прямом погружении в жидкий азот. 3 17672 1 2013.10.30 Для изучения сохранения чувствительности бактерий к бактериофаговой инфекции,размороженную суспензию клеток вносили в свежую порцию среды культивирования и инкубировали при постоянном перемешивании при 28 С в течение 1 ч. Далее культуру клеток заражали бактериофагом в соотношении 11. Через каждые 10 мин отбирали равные аликвоты культуральной жидкости и измеряли ОП при 590 нм. О скорости лизиса судили по уменьшению ОП. На фиг. 2 представлены данные о сохранении чувствительности бактерий к фаговой инфекции. Из результатов видно, что чувствительность к бактериофагам также подвержена влиянию замораживания, однако в меньшей степени. Так же, как и в предыдущих опытах, наилучшие результаты сохранности клеток были достигнуты при замораживании в жидком азоте со сверхбыстрой скоростью охлаждения. Пример 3. Влияние криопротекторов на выживаемость бактерий. Выращенные клетки осаждают центрифугированием, после чего ресуспендируют в стерильных растворах криопротекторов, раскапывают по криопробиркам, охлаждают на ледяной бане до 0 С и замораживают в жидком азоте. В качестве криопротекторов служат сахароза, диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерол в концентрациях 10,5 и 10 соответственно. Через 24 ч образцы оттаивают на водяной бане при 37 С. Титр жизнеспособных клеток определяют стандартным методом предельных разведений с последующим высевом на чашки. В табл. 2 представлены данные о выживаемости бактерий . после замораживания с различными криопротекторами. Таблица 3 Криопротектор Сахароза 10 Диметилсульфоксид 5 Глицерин 10 Из представленных данных видно, что использование 10 сахарозы в качестве криопротектора позволяет существенно увеличить выживаемость бактерий при криоконсервации. Пример 4. Влияние криопротекторов на сохранение физиологической активности культуры бактерий. Выращенные клетки осаждают центрифугированием, после чего ресуспендируют в стерильных растворах криопротекторов, раскапывают по криопробиркам, охлаждают на ледяной бане до 0 С и замораживают в жидком азоте. В качестве криопротекторов служат сахароза, диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерол в концентрациях 10,5 и 10 соответственно. Через 24 ч образцы оттаивают на водяной бане при 37 С. Для изучения скорости накопления биомассы культуры, подвергавшейся криоконсервации, размороженную суспензию клеток вносят в свежую порцию стерильной питательной среды в соотношении 1 мл культуры на 50 мл среды, инкубируют при 28 С при постоянном перемешивании. Каждые 20 мин отбирают равные аликвоты культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность (ОП) при 590 нм. О сохранении физиологической активности судят по скорости накопления биомассы, т.е. по увеличению ОП. В качестве контроля служит суспензия клеток, не подвергавшихся криоконсервации. На фиг. 3 представлены данные о скорости накопления биомассы при культивировании бактерий, подвергшихся криоконсервации с указанными криопротекторами. Полученные результаты свидетельствуют, что 10 сахароза обеспечивает самые высокие показатели сохранения физиологической активности замораживаемых клеток. Для изучения сохранения чувствительности бактерий к бактериофаговой инфекции размороженную суспензию клеток вносили в свежую порцию среды культивирования и инку 4 17672 1 2013.10.30 бировали при постоянном перемешивании при 28 С в течение 1 ч. Далее культуру клеток заражали бактериофагом в соотношении 11. Через каждые 10 мин отбирали равные аликвоты культуральной жидкости и измеряли ОП при 590 нм. О скорости лизиса судили по уменьшению ОП. Представленные на фиг. 4 данные о сохранении чувствительности бактерий к вирусной инфекции свидетельствуют, что 10 сахароза, как и в предыдущих случаях, обеспечивает наивысший уровень сохранения чувствительности клеток к бактериофагам. Пример 5. Влияние температуры хранения бактерийна их выживаемость при длительном консервировании. Замороженные с оптимальной скоростью образцы хранят в жидком азоте при -196 С,а также в морозильниках при -70 и -20 С. Часть образцов оттаивают сразу же после заморозки и измеряют количество жизнеспособных клеток. Полученные показатели используются в дальнейшем в качестве контроля. Через 3 и 6 месяцев хранения образцы размораживают и исследуют выживаемость бактерий. Таблица 4 Выживаемость бактерий Режим хранеконтроль через 3 месяца через 6 месяцев ния, С КОЕ/мл(8,80,43)109 100 (7,650,04)109 87 (6,970,09)109 79 Данные о выживаемости бактерийпри длительном хранении суммированы в табл. 3. Из представленных результатов видно, что хранение замороженных бактерий при 70 С обеспечивает наиболее высокие показатели выживаемости псевдомонад. Согласно полученным данным предлагаемый способ длительного консервирования бактерийпревосходит ранее предложенный метод (прототип). Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем 1. Оптимизация температурных режимов криоконсервации, а также подбор нужного криопротектора позволяют добиться более высокого уровня выживаемости псевдомонад в сравнении с ранее предложенным способом. Так, при консервировании клеток с помощью описанного метода потеря жизнеспособности бактерий не превышает 6 непосредственно после замораживания, а также около 15 в течение 6 месяцев хранения. Потери жизнеспособности клеток при использовании прототипа могут составлять более 80 непосредственно при замораживании и до 10 в течение первых суток хранения. 2. Используемый криопротектор (10 сахароза) не является токсическим веществом,не проявляет мутагенных и канцерогенных свойств и поэтому не требует удаления из клеточной суспензии клеток перед ее дальнейшим использованием. Источники информации 1. Тахтаджян А.Л., Жуковский П.М., Красильников Н.А. Введение. Бактерии и актиномицеты. Жизнь растений / Под ред. Н.А. Красильников, А.А. Уранов. - М. Просвещение 1982. - Т. 1. - С. 102-110. 2..-,-1 // . . - 1998. - . 62. - . 11. - . 2091-2097. 3. , ,.// . - 1981. - . 18. - . 592-597. 5- // . . . - 1979. - . 37. - . 369-372. 6..,.,.// . . . - 1972. - . 35. - . 185-191. 7. , .,.,.// . - 1975. - . 12. - . 15-25. 8..// . . . - 1962. - . 10. - . 297-301 (прототип). 9. Бронштейн В.Л. и др. Криоконсервация молочнокислых стрептококков // Криобиология и криомедицина. - 1983. - Вып. 12. - С. 35-38. Фиг. 1. Динамика накопления биомассы бактериямипосле замораживания с разными скоростями охлаждения Фиг. 2. Лизис клетокбактериофагом после замораживания с разными скоростями охлаждения Фиг. 3. Динамика накопления биомассы бактериямипосле замораживания с разными криопротекторами Фиг. 4. Лизис клетокбактериофагом после замораживания с разными криопротекторами Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7