Способ создания бицистронного лентивирусного вектора доставки pHR-CMV-DRep, кодирующего репортерные белки DsRed1 и eGFP

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ СОЗДАНИЯ БИЦИСТРОННОГО ЛЕНТИВИРУСНОГО ВЕКТОРА ДОСТАВКИ , КОДИРУЮЩЕГО РЕПОРТЕРНЫЕ БЕЛКИ 1 И(71) Заявители Белорусский государственный университет Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий(72) Авторы Гринев Василий Викторович Посредник Дмитрий Вячеславович Северин Игорь Николаевич Потапнев Михаил Петрович(73) Патентообладатели Белорусский государственный университет Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий(56)7250299 1, 2007.2305708 2, 2007.2280074 2, 2006. ГРИНЕВ В.В. и др. Генетика и биотехнологиявека. Фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы Международной научной конференции. - Минск, 2008. - С. 295-297. НИКОЛАЕВИЧ Э.А. и др. Генетика и биотехнологиявека. Фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы Международной научной конференции. - Минск, 2008. - С. 312-315. ШАХБАЗОВ А.В. и др. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2008. -4. - С. 216-218... - 2005. . 5. - . 1. - . 555-565. .(57) Способ создания бицистронного лентивирусного вектора доставки ,кодирующего репортерные белки 1 и , заключающийся в том, что гидролизуют ДНК лентивирусного вектора доставки рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и щелочной фосфатазой , соединяют ДНК-лигазой 17654 1 2013.10.30 с обработанной фрагментом Кленова последовательностью ДНК, содержащей ранний энхансер/промотор цитомегаловируса человека, точку начала транскрипции, консенсусную последовательность Козак и открытую рамку считывания белка 1, и отбирают молекулы бицистронного лентивирусного вектора доставки путем трансформации лигированной смесью бактерий .5. Изобретение относится к способам векторного переноса генов в клетки человека и может быть использовано для генетической модификации мезенхимальных стволовых клеток человека костномозгового происхождения сопряженной парой генов с целью индукции дифференцировки этих клеток и/или последующего их использования в качестве клеточных векторов в генной терапии. Известен ряд методов переноса генов, клонированных в составе челночных плазмидных векторов, в мезенхимальные стволовые клетки человека, наиболее распространенными из которых являются перенос генов с помощью липофекции 1, электропорации 2,нуклеофекции 1, 3 или ко-преципитации плазмидной ДНК с фосфатом кальция 1. Другой группой аналогов предложенного способа является перенос генов с помощью ретровирусных векторов 4 или векторов, основанных на аденовирусах 5, 6 или аденоассоциированных вирусах 7. К ключевым недостаткам невирусных методов относятся 1) низкая эффективность переноса генов, 2) высокая цитотоксичность по отношению к модифицируемым клеткам,3) эписомное состояние вектора в стволовых клетках, что не позволяет стабильно поддерживать перенесенный ген в модифицированных клетках на протяжении длительного времени. Основными недостатками вышеприведенных вирусных методов являются 1) невысокая эффективность переноса генов, 2) зависимость эффективности переноса генов от пролиферативного статуса модифицируемых клеток, 3) низкая емкость векторов (в случае с ретровирусными векторами и векторами на основе аденоассоциированных вирусов),4) эписомное состояние вектора в модифицированных клетках (в случае с векторами на основе аденовирусов). Наиболее близким аналогом предложенного решения является способ переноса генов в мезенхимальные стволовые клетки человека с помощью моноцистронных лентивирусных векторов 8. Он заключается в следующем. Лентивирусный геном состоит из трех генов ,и , фланкированных длинными концевыми повторами. Генкодирует внутренние структурные белки (белки матрикса, капсида и нуклеокапсида), -ген кодирует обратную транскриптазу, протеазу и интегразу, генкодирует гликопротеины вирусной оболочки. 5 и 3 длинные концевые повторы служат для усиления транскрипции и полиаденилирования вирусной РНК, кроме того, они содержат цис-действующие последовательности, необходимые для вирусной репликации. Данный способ предполагает разделение вирусных генов по нескольким векторам, которыми затем будет котрансфецироваться пакующая линия. Первый вектор может содержать геныи ,второй - ген , третий вектор является вектором доставки, содержит чужеродный ген и именно его РНК будет упакована в вирусные частицы. Такое разнесение вирусных генов по разным векторам позволяет 1) использовать генразличных вирусов для инфицирования частицами широкого спектра клеток 2) позволяет значительно увеличить емкость вирусного капсида. Для безопасного использования системы из трех векторов предусмотрен ряд модификаций вирусного генома, предотвращающих появление вируса дикого типа за счет рекомбинации векторов между собой, а также размножения рекомбинантного лентивируса в клетках-мишенях. Для получения рекомбинантных лентивирусных частиц клетки пакующей линии ко-трансфецируются всеми тремя векторами. В клетках происхо 2 17654 1 2013.10.30 дит образование белков капсида, сборка капсидов и упаковка в них РНК вируса, содержащую последовательность чужеродного гена, за счет наличия пси-последовательности. Вирусные частицы собираются и используются для трансдукции клеток-мишеней. РНК вносится в клетки и служит в качестве матрицы для синтеза ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Вносимый чужеродный ген может кодировать полипептиды, рибозимы либо антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот. Перед другими методами доставки (невирусными и вирусными) генов в стволовые клетки данный способ имеет следующие преимущества 1) лентивирусные векторы обеспечивают высокую частоту трансдукции, что обусловлено их способностью модифицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки 2) лентивирусные вектора в отличие от аденовирусных векторов или челночных плазмидных векторов обеспечивают стабильную интеграцию трансгена в хромосомальную ДНК 3) для лентивирусных векторов, по сравнению с ретровирусными векторами, менее характерно эпигенетическое подавление экспрессии трансгена, что, в совокупности с их предыдущей особенностью, обеспечивает стабильную и длительную экспрессию переносимого гена в клетках-мишенях 4) лентивирусные векторные системы второго и третьего поколений включают целый комплекс модификаций и улучшений, гарантирующих их безопасность (в плане рекомбинации и появления вируса дикого типа). Недостатком вышеописанного способа является моноцистронность данной лентивирусной системы, что увеличивает временные и материальные затраты на продукцию рекомбинантных лентивирусов и проведения трансдукции, а также повышает вероятность инсерционного мутагенеза в модифицированных клетках в силу необходимости проводить две независимые трансдукции для одновременной модификации стволовых клеток двумя генами. Задачей изобретения является разработка подхода создания бицистронного лентивирусного вектора доставки с целью уменьшения затрат на продукцию рекомбинантных вирусов и уменьшения вероятности инсерционного мутагенеза в модифицированных клетках. Техническим результатом предлагаемого изобретения является объединение двух открытых рамок считывания, кодирующих два разных белка, в единую бицистронную экспрессионную кассету с помощью участка внутренней посадки рибосомы от вируса энцефаломиокардита и ее перенос в стволовые клетки с помощью лентивирусного вектора доставки. Поставленная задача решается тем, что гидролизуют ДНК лентивирусного вектора доставки рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и щелочной фосфатазойи соединяют ДНК-лигазой с обработанной фрагментом Кленова последовательностью ДНК, содержащей ранний энхансер/промотор цитомегаловируса человека, точку начала транскрипции, консенсусную последовательность Козак и открытую рамку считывания белка 1, и отбирают молекулы бицистронного лентивирусного вектора доставки путем трансформации лигированной смесью бактерий .5. Бицистронным лентивирусным вектором доставки - совместно с плазмидным вектором оболочки 2. и плазмидным вектором упаковки 8.91 ко-трансфецируют клетки линии 293 эмбриональной почки человека, спустя 72 ч собирают культуральную среду, содержащую произведенные клетками линии 293 рекомбинантные лентивирусные частицы, добавляют собранную среду к растущей культуре мезенхимальных стволовых клеток человека и инкубируют последние на протяжении 16 ч в присутствии 8 мкг/мл полибрина, проводят полную смену культуральной среды, дополнительно инкубируют трансдуцированные мезенхимальные стволовые клетки на протяжении дополнительных 72 ч, оценивают эффективность переноса и работы бицистронной экспрессионной кассеты по экспрессии зеленого флуоресцирующего белка-репортерана проточном цитофлуориметре или под флуоресцентным микро 3 17654 1 2013.10.30 скопом, а экспрессию целевого белка с помощью Вестерн-блоттинга, иммунофлуоресценции или иного подходящего метода. Бицистронный лентивирусный вектор доставки , запаковываемый в вирусные частицы, область которого фланкирована немодифицированным 5- и самоинактивирующимся (с делетированным 3 регионом) 3- от вируса иммунодефицита человека и содержит сигнал упаковки - 4, элемент , ответственный за связывание с белкоми перенос векторной РНК из ядра вирус-продуцирующей клетки в цитоплазму, центральный полипуриновый тракт сРРТ, участвующий в сборке преинтеграционного комплекса вируса и его переносе из цитоплазмы инфицированной клетки в ядро,посттранскрипционный стабилизирующий элементот вируса гепатитасевероамериканского лесного сурка и внутренний ранний энхансер/промотор цитомегаловируса человека, контролирующий транскрипцию двух открытых рамок считывания, объединенных участком внутренней посадки рибосомыот вируса энцефаломиокардита в единую бицистронную экспрессионную кассету. Сущность изобретения заключается в следующем с помощью генно-инженерных методов конструируют лентивирусный вектор доставки, внутренний промотор которого контролирует транскрипцию бицистронной мРНК. Такого рода бицистронную экспрессионную кассету проектируют так, что она кодирует одновременно два разных целевых белка, причем трансляция одного из них, открытая рамка считывания которого располагается проксимально по отношению к промотору, зависит от консенсуса Козак, а второго, открытая рамка считывания которого располагается дистально, зависит от последовательности для внутренней посадки рибосомы от вируса энцефаломиокардита. Сконструированный с учетом вышеизложенного лентивирусный вектор доставки используют для переноса бицистронной экспрессионной кассеты в мезенхимальные стволовые клетки человека путем лентивирусной трансдукции, обеспечивающей высокоэффективную и стабильную генетическую модификацию этих клеток. Сущность изобретения поясняется на фиг. 1-4. На фиг. 1 показана схема молекулярно-генетической организации базового лентивирусного вектора доставки с указанием сайтов рестрикции для рестриктазы , по которым может быть осуществлено клонирование внутреннего промотора и первой открытой рамки считывания, на фиг. 2 представлена схема организации запаковываемой в вирусные частицы области лентивирусного вектора доставки, на фиг. 3 представлена микрофотография мезенхимальной стволовой клетки, экспрессирующей генпосле трансдукции лентивирусным вектором, на фиг. 4 - микрофотография мезенхимальной стволовой клетки, экспрессирующей ген 1 после трансдукции лентивирусным вектором . Примеры осуществления способа. Пример 1. Производят забор аспирата красного костного мозга из подвздошной кости пациента или здорового донора. Данный аспират в лабораторных условиях разделяют центрифугированием на градиенте плотности 1,077 г/мл. Мононуклеарные клетки из интерфазы подвергают селекции на культуральном пластике и пересевают до получения чистой культуры мезенхимальных стволовых клеток. Полученную культуру используют для последующей генетической модификации. В качестве базовой конструкции, обеспечивающей перенос и интеграцию бицистронной экспрессионной кассеты в геномную ДНК мезенхимальных стволовых клеток человека, используют лентивирусный вектор доставки второго поколения . Данный вектор имеет длинные концевые повторы(немодифицированный 5- и самоинактивирующийся (с делетированным 3 регионом) 3-) от вируса иммунодефицита человека, содержит сигнал упаковки - 4, элемент , ответственный за связывание с белкоми перенос векторной РНК из ядра вирус-продуцирующей клетки 4 17654 1 2013.10.30 в цитоплазму, центральный полипуриновый тракт сРРТ, участвующий в сборке преинтеграционного комплекса вируса и его переносе из цитоплазмы инфицированной клетки в ядро и посттранскрипционный стабилизирующий элементот вируса гепатита В североамериканского лесного сурка. Геном-репортером в векторе является ген , транскрипция которого находится под контролем конститутивного промотораот вируса Френд, а трансляция - участком внутренней посадки рибосомыот вируса энцефаломиокардита. Недостатком описанного вектора является использование промотораот вируса Френд в качестве внутреннего промотора, так как этот промотор 1) обладает относительной тканевой специфичностью (работает преимущественно в гемопоэтической и лимфоидной тканях) и 2) чувствителен к постинтеграционному сайленсингу. Однако наличие двух сайтов для рестриктазы(позиции 7748 и 8274), фланкирующих промотори полилинкер в векторе , позволяет в одно клонирование заменить данный фрагмент на новый промотор с одновременным включением в вектор новой открытой рамки считывания. Для создания бицистронного лентивирусного вектора доставки , кодирующего два разных белка - красный флуоресцирующий белок 1 и зеленый флуоресцирующий белок , ДНК лентивирусного вектора гидролизуют рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и щелочной фосфатазойи соединяют ДНК-лигазой с обработанной фрагментом Кленова последовательностью ДНК, содержащей ранний энхансер/промотор цитомегаловируса человека, точку начала транскрипции, консенсус Козак открытую рамку считывания белка 1 из челночного плазмидного вектора -1, лигированной смесью трансформируют бактерии Е.5 и среди трансформантов на среде с ампициллином отбирают варианты рекомбинантных векторных молекул, характеризующиеся правильной ориентацией клонированной последовательности. Для последующей высокоэффективной и стабильной генетической модификации мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью лентивирусного вектора доставки указанным вектором совместно с плазмидным вектором оболочки 2. и плазмидным вектором упаковки 8.91 ко-трансфецируют клетки линии 293 эмбриональной почки человека. Спустя 72 ч после ко-трансфекции собирают культуральную среду, содержащую произведенные клетками линии 293 рекомбинантные лентивирусные частицы, добавляют собранную среду к растущей культуре мезенхимальных стволовых клеток человека и инкубируют последние на протяжении ночи в присутствии 8 мкг/мл полибрина. По окончании ночной инкубации проводят полную смену культуральной среды, проводят дополнительную инкубацию трансдуцированных мезенхимальных стволовых клеток на протяжении 72 ч, после чего оценивают эффективность переноса и работы бицистронной экспрессионной кассеты по экспрессии красного и зеленого флуоресцирующих белков на проточном цитофлуориметре или под флуоресцентным микроскопом (фиг. 3-4). Пример 2. Вместо последовательности, кодирующей белок 1, используют гибридную нуклеотидную последовательность, одновременно кодирующую белок 1 и искусственную микроРНК, направленную против целевого гена в мезенхимальных стволовых клетках. Таким образом, предлагаемый способ позволяет одновременно переносить в мезенхимальные стволовые клетки два гена, кодирующие три разных продукта белок , служащий индикатором эффективности переноса и экспрессии бицистронной кассеты в мезенхимальные стволовые клетки, белок 1, который является индикатором эффективности процессинга искусственных микроРНК в модифицированных клетках, и искус 5 17654 1 2013.10.30 ственные микроРНК, позволяющие подавлять целевые гены в мезенхимальных стволовых клетках. Источники информации 1..-.,.,.,.-// Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7