Способ определения у больного чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепарату или к группе химиопрепаратов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ У БОЛЬНОГО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ К ХИМИОПРЕПАРАТУ ИЛИ К ГРУППЕ ХИМИОПРЕПАРАТОВ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(72) Авторы Шуканова Наталия Андреевна Пинчук Сергей Владимирович Мартынова Мария Алексеевна Путырский Леонид Алексеевич Козловская Наталья Александровна Путырский Юрий Леонидович(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(57) Способ определения у больного чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепарату или к группе химиопрепаратов, заключающийся в том, что получают гомогенат ткани из операционного материала рака молочной железы, инкубируют его в течение 46-50 ч в присутствии и в отсутствие химиопрепарата или группы химиопрепаратов, клетки рака молочной железы осаждают из гомогената ткани центрифугированием, определяют в них фотометрически с реактивом Эллмана и ацетилтиохолина йодидом активность ацетилхолинэстеразы, рассчитывают коэффициент степени влияния химиопрепарата или группы химиопрепаратов на клетки рака молочной железы КАХЭ по формуле КАХЭ 1/2,где 1 и 2 - соответственно активность ацетилхолинэстеразы в клетках рака молочной железы, осажденных из гомогената ткани, инкубированного в присутствии и в отсутствие химиопрепарата или группы химиопрепаратов, и считают клетки рака молочной железы чувствительными к химиопрепарату или к группе химиопрепаратов при КАХЭ 1 или резистентными при КАХЭ 1. Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для оптимизации выбора индивидуальных схем применения химиопрепаратов при адъювантной химиотерапии. 17447 1 2013.08.30 Одними из наиболее адекватных тестовых систем для определения у больного индивидуальной чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепаратам являются первичные культуры клеток, получаемые из оперативно удаленной опухоли. Известен способ определения индивидуальной чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепаратам, основанный на культивировании эксплантатов опухолевой ткани в капиллярном пространстве между предметными стеклами, при этом оценка химиочувствительности производится по степени снижения прироста площади культур под влиянием химиопрепаратов по сравнению с контролем 1. Недостатком данного способа является значительная вероятность погрешности при визуальном определении площади культур под микроскопом, а также ограниченные возможности автоматизации анализа результатов культивирования эксплантатов без и в присутствии химиопрепаратов. Известен способ определения у больного чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепаратам, основанный на культивировании измельченной ткани молочной железы в диффузионной камере в питательной среде 1640 2. Результаты культивирования измельченной ткани без и в присутствии химиопрепаратов оценивают по морфологической 9-балльной системе оценки роста опухолевых эксплантатов в условияхс использованием микроскопа. Недостатком данного способа являются субъективная оценка результатов культивирования, ограниченные возможности автоматизации анализа результатов культивирования и необходимость наличия высококвалифицированного персонала. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения у больного чувствительности к химиопрепаратам клеток рака молочной железы (РМЖ) в условиях, основанный на измерении активности внутриклеточных дегидрогеназ (прототип) 3. Способ осуществляется путем забора операционного материала иссечения его на части,не более 1 мм 3 пропускания иссеченной ткани через металлическое сито из нержавеющей стали 100, двойного отмывания клеток в забуференном фосфатами физиологическом растворе, помещения клеток в питательную среду 1640 подсчета клеток внесения в ячейки стерильной микроплаты по 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1106 кл/мл добавления в ячейки по 20 мкл исследуемого противоопухолевого препарата инкубации в 2-инкубаторе в течение 72 ч добавления в каждую ячейку по 20 мкл раствора 3-(4,5 диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2-тетразолия бромида (МТТ) в концентрации 5 мг/мл инкубации в течение 6-8 ч при 37 С центрифугирования в течение 10 мин при 200 отбора супернатанта добавления в каждую ячейку по 100 мкл диметилсульфоксида помещения платы в шейкер при комнатной температуре на 5 мин измерения оптической плотности при длине волны 570 нм расчета степени выживаемости клеток по специальной формуле если активность внутриклеточных дегидрогеназ в образце, содержащем химиопрепарат, была меньше, чем в контроле (суспензия клеток без химиопрепарата),клетки РМЖ считались чувствительными к действию химиопрепарата если же активность внутриклеточных дегидрогеназ в суспензии клеток, содержащей химиопрепарат, не изменялась или была выше контрольного значения, клетки РМЖ считались резистентными к действию химиопрепарата. Недостатком такого способа являются трудоемкость и длительность процедуры определения активности внутриклеточных дегидрогеназ. Задача изобретения - разработка простого, дешевого и надежного способа оценки индивидуальной чувствительности клеток рака молочной железы к применяемым химиопрепаратам. Указанная задача решается следующим образом. Способ определения у больного чувствительности клеток рака молочной железы к химиопрепарату или группе химиопрепаратов заключается в том, что сначала получают гомогенат клеток рака молочной железы из операционного материала. После чего его культивируют в течение 46-50 ч в присутствии и в отсутствие химиопрепарата или группы химиопрепаратов. Затем его осаждают центрифугированием и определяют фотометриче 2 17447 1 2013.08.30 ски с реактивом Эллмана и ацетилтиохолина йодидом активность ацетилхолинэстеразы в клетках рака молочной железы, культивированных в присутствии 1 и в отсутствие химиопрепарата или группы химиопрепаратов 2. После этого рассчитывают коэффициент степени влияния химиопрепарата или группы химиопрепаратов на клетки рака молочной железы КАХЭ по формуле КАХЭ 1/2,и считают клетки рака молочной железы чувствительными к химиопрепарату или к группе химиопрепаратов при КАХЭ 1 или резистентными при КАХЭ 1. Существенными отличительными признаками изобретения являются использование первичной культуры, полученной из гомогената опухолевой ткани, что позволило существенно сократить время культивирования, которое составило 46-50 ч, проведение процесса фотометрирования для измерения активности ацетилхолинэстеразы и расчет коэффициента степени влияния КАХЭ по формуле, что позволило значительно упростить и сократить способ, а результаты сделать более достоверными. За счет наличия в гомогенате опухолевой ткани стромальных клеток влияние химиопрепаратов на клетки РМЖ в первичной культуре в заявляемом способе более приближены к условиям. Совокупность отличительных существенных признаков заявляемого изобретения является новой. Способ осуществляют следующим образом. В стерильных условиях операционный материал (1,5-2 см 3) после удаления некротических участков, сосудов и жировой ткани иссекают ножницами, помещают в питательную среду 1640 (6 мл) и гомогенизируют в слабо притертом гомогенизаторе. Гомогенат разливают в пенициллиновые флаконы по 2 мл. Количество флаконов определяется количеством исследуемых составов с химиопрепаратами плюс один флакон для контроля. Нами исследовались две группы химиопрепаратов первая состояла из циклофосфана (10-3 моль/л), метотрексата (10-3 моль/л) и 5-фторурацила (10-5 моль/л) - группа , вторая - из циклофосфана(10-3 моль/л) и доксорубицина (10-4 моль/л) - группа . Выбранные концентрации препаратов соответствуют литературным данным по исследованию химиочувствительности клеток в культурах 4, 5. Гомогенат в первом флаконе инкубируют без химиопрепаратов, во второй флакон добавляют химиопрепараты группы , а в третий - группы . Образцы инкубируют в 2-инкубаторе при 37 С в течение 46-50 ч. После инкубации гомогенат переносят в эппендорфы и центрифугируют 10 мин при 6000 . Надосадочную жидкость декантируют, осадок ресуспензируют в забуференном фосфатами физиологическом растворе ( 7,4) и переосаждают 2 раза, центрифугируя 7 мин при 300 . В суспензию клеток добавляют реактив Эллмана в конечной концентрации 200 мкмоль/л, инкубируют 15 мин при 37 С, добавляют ацетилтиохолина иодид и фотометрируют при 412 нм сразу после добавления субстрата и через каждые 5 мин инкубации. Активность ацетилхолинэстеразы (активность АХЭ) выражают в концентрации гидролизированного субстрата в единицу времени (мин),приведенную к единице концентрации белка (мг/мл), определяемого по стандартной методике Лоури 6. Значение молярного коэффициента экстинкции при 412 нм принимают равным 1,3610-4 (моль/л)-1 см-1 7. После этого рассчитывают коэффициент степени влияния КАХЭ по формуле КАХЭ 1/2,и считают клетки рака молочной железы чувствительными к химиопрепарату или к группе химиопрепаратов при КАХЭ 1 или резистентными при КАХЭ 1. Эти же группы химиопрепаратов исследовались по способу, описанному в прототипе,путем измерения активности внутриклеточных дегидрогеназ (МТТ-тест). Обследовалась группа из 28 больных РМЖ. Результаты исследований представлены в таблицах. Так, в табл. 1 представлена сравнительная характеристика влияния группы препаратовна активность АХЭ (коэффициент степени влияния КАХЭ) и активность дегидрогеназ 3 17447 1 2013.08.30 МТТ-тест (коэффициент КМТТ) клеток РМЖ в первичной культуре. В табл. 2 представлена сравнительная характеристика влияния группы препаратов АС на активность АХЭ (коэффициент степени влияния КАХЭ) и активность дегидрогеназ - МТТ-тест (коэффициент КМТТ) клеток РМЖ в первичной культуре. Таблица 1 МТТ-тест, 570 Паци- Активность АХЭ, нМ/(мг белкамин) ентка контроль КАХЭ контроль АС КМТТ 1,18 1,32 1,12 0,041 0,050 1,22 Примечаниев табл. 1 и 2 погрешность измерения активности ферментов не превышала 5-8 коэффициент КАХЭ равен отношению активности АХЭ клеток после культивирования с химиопрепаратами к активности АХЭ клеток после культивирования без химиопрепаратов и отражает степень влияния химиопрепаратов на клетки РМЖ в культуре чувствительность клеток к химиопрепаратам тем выше, чем КАХЭ меньше единицы. При КАХЭ 1 клетки резистентны, а при КАХЭ 1 химиопрепараты усиливают клеточную пролиферацию, следовательно, при КАХЭ 1 химиопрепараты применять при лечении больных не рекомендуется. Как видно из табл. 1, 2, при воздействии обеих групп химиопрепаратов наблюдается изменение активности АХЭ. АХЭ - широко известный фермент гидролиза ацетилхолина,осуществляющий холинэргическую нейротрансмиссию в возбудимых тканях. Однако получен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что АХЭ экспрессируется во многих типах невозбудимых тканей и играет существенную роль в пролиферации, дифференцировке, миграции и неопластической трансформации клеток 8. Так,например, гены АХЭ амплифицируются в лейкемических клетках и клетках карциномы яичников 9, 10. В неопластических образованиях мозга они структурно изменены 11. АХЭ проявляет аномальные свойства в менингиомах, глиобластомах, карциномах мочевого пузыря и других опухолях 12, 13. Обнаружены различия в активности АХЭ опухолей и соседней здоровой ткани мозга активность АХЭ в нормальной ткани мозга составляет 3,8 нмоль/(мг белкамин), в нейриноме - 8,5, а в глиоме - 12,7 нмоль/(мг белкамин). В клетках опухолевой ткани больных РМЖ активность АХЭ выше, чем в норме, и составляет 4 17447 1 2013.08.30 3,09 и 1,61 нмоль/(мг белкамин) соответственно 14. Установлено также, что активность АХЭ раковых клеток солидных опухолей коррелирует со степенью злокачественности 13, следовательно, снижение активности АХЭ клеток РМЖ при инкубации с химиопрепаратами по сравнению с контролем (инкубация без химиопрепаратов) может указывать на ингибирование пролиферативной активности злокачественно трансформированных клеток в культуре и свидетельствовать о чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическому действию используемых препаратов. Отсутствие изменения активности АХЭ или ее увеличение можно рассматривать как факт, указывающий на резистентность клеток РМЖ к химиопрепаратам. Сопоставление результатов исследования влияния химиопрепаратов на клетки РМЖ в культуре, полученных с использованием МТТ-теста и измерения активности АХЭ, показывает, что изменение активности АХЭ и внутриклеточных дегидрогеназ при культивировании клеток без и в присутствии химиопрепаратов имеет одинаковую направленность,т.е. при снижении активности АХЭ уменьшается активность дегидрогеназ, а с ростом активности АХЭ активность дегидрогеназ повышается. Взятый нами за прототип способ определения индивидуальной химиочувствительности опухоли у больных в первичной культуре клеток с использованием МТТ-теста 15 хорошо коррелировал с действием препаратов. После статистической обработки результатов, полученных в условиях, исследователями были даны рекомендации по применению препаратов в клинике. По истечении 3 лет после проведенного курса химиотерапии сравнительный анализ показал, что в случаях резистентности клеток РМЖ к химиопрепаратам в культуре курс химиотерапии в 100 случаев не давал положительного результата. Использование химиопрепаратов, к которым была определена чувствительность клеток в условиях, оказалось эффективным в 80 случаев. В нашем случае проведено сравнение результатов, полученных при исследовании влияния химиопрепаратов на активность АХЭ в первичной культуре клеток опухоли отдельных пациенток, с результатами их клинического лечения. Примеры конкретного выполнения способа. Пример 1. Больной П. (51 год) с верифицированным диагнозом рак молочной железы произведена мастэктомия. В операционной стерильным скальпелем иссекли 2 кусочка опухолевой ткани (111,5 см 3), поместили в стерильный пенициллиновый флакон с питательной средой 1640 с добавлением антибиотика (50 мкг/мл гентамицина). Флакон закрыли резиновой пробкой и доставили в лабораторию. Все дальнейшие работы проводили в стерильном боксе в ламинарном шкафу. Через 46 ч культивирования клеток РМЖ без химиопрепаратов активность АХЭ составила 9,6 нмоль/(мг белкамин), в присутствии группы химиопрепаратовактивность АХЭ уменьшилась до 6,1 нмоль/(мг белкамин), а после инкубации с препаратами группыуменьшилась до 3,8 нмоль/(мг белкамин). Больную пролечили химиопрепаратами группы , для которой коэффициент КАХЭ 0,4, т.е. химиопрепараты группыинтенсивно ингибировали клеточную пролиферацию в условиях. Результаты наблюдения за состоянием больной в течение 4 лет свидетельствуют об отсутствии рецидивов, т.е. успешном лечении. Пример 2. Больной Д. (43 года) с верифицированным диагнозом рак молочной железы произведена мастэктомия. Далее все процедуры определения влияния чувствительности клеток РМЖ к химиопрепаратам в условияхпроводили, как описано в примере 1. Через 49 ч культивирования клеток РМЖ без химиопрепаратов активность АХЭ составила 1,18 нмоль/(мг белкамин), в присутствии группы препаратовактивность АХЭ не изменилась и составила 1,11 нмоль/(мг белкамин), а после инкубации с препаратами группынесколько увеличилась до 1,32 нмоль/(мг белкамин). Больную пролечили химиопрепаратами группы , для которой коэффициент КАХЭ 1,12, т.е. химиопрепара 5 17447 1 2013.08.30 ты группыне только не ингибировали клеточную пролиферацию в условиях,но наблюдалось увеличение количества клеток в культуре. Больная умерла через 1 год. Таким образом, для определения чувствительности клеток РМЖ в первичной культуре может быть использовано определение влияния химиопрепарата или группы химиопрепаратов на активность клеточной АХЭ. Преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом (МТТ-тест) является удешевление и ускорение процедуры определения чувствительности клеток РМЖ. Время инкубации клеток в первичной культуре без и в присутствии химиопрепаратов в прототипе составляет 72 ч, в заявляемом способе - 46-50 ч. Время определения активности АХЭ составляет от 20 до 30 мин, тогда как для определения активности внутриклеточных дегидрогеназ необходима инкубация в течение 6-8 ч. Определение активности АХЭ не требует наличия 2-инкубатора, который необходим для МТТ-теста. Кроме того, преимуществом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение точности определения химиочувствительности клеток РМЖ, т.к. активность АХЭ злокачественно трансформированных клеток молочной железы в 2 раза выше, чем клеток нормальной ткани, а при использовании МТТ-теста в активность дегидрогеназ вносят вклад все активно пролиферирующие клетки, включая и незлокачественные. Предлагаемый способ реализуется с применением недорогой, серийно выпускаемой аппаратуры. Персонал для работы по заявленному способу можно обучить за короткий срок. Источники информации 1. Пашкова В.С., Филиппова Л.А., Лавренов А.Л. Способ определения индивидуальной химиочувствительности опухоли у больных//2094802, 1997. 2. Чешук В.Е., Захарцева Л.М., Бережная Н.М. Изучение чувствительности эксплантантов рака молочной железы к противоопухолевым препаратам // Онкология. - 2002. - Т. 4. С. 263-267. 3.,,.//. - 1998. - . 49. - . 251-259. 4..,.,//. - 1995. - . 1. - . 305-311. 5. Ищенко Р.В. Методика капельно-плазменного культивирования опухолевой ткани для экспресс-определения индивидуальной чувствительности к химиопрепаратам // Онкология. - 2002. - Т. 4. -1. - С. 15-17. 6.,,,// - 1951. - . 193. - . 1. - . 265-275. 7..,-// . . - 1968. - . 25. - . 192-205. 8.,.,. -,//. 1996. - . 28. - . 5-6. - . 453-483. 9..,.,.. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7