Серебросодержащий антифунгальный агент широкого спектра действия

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СЕРЕБРОСОДЕРЖАЩИЙ АНТИФУНГАЛЬНЫЙ АГЕНТ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ(71) Заявитель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(72) Авторы Логинова Наталья Васильевна Чернявская Анна Анатольевна Осипович Николай Павлович Ковальчук Татьяна Вячеславовна Полозов Генрих Иванович Шадыро Олег Иосифович(73) Патентообладатель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(56)2298402 2, 2007.2006/109898 1. Химические проблемы создания новых материалов и технологий. - Минск, 2008.(57) Применение комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой формулы 17021 1 2013.04.30 в качестве антифунгального агента широкого спектра действия, имеющего активность в отношении дерматофитов и характеризующегося низкой токсичностью. Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в качестве антифунгального средства широкого спектра действия. В связи с тенденцией к росту числа грибковых заболеваний (как поверхностных, так и тяжелых висцеральных микозов, ассоциированных с ВИЧ-инфекцией и онкогематологическими заболеваниями), развитием устойчивости возбудителей к имеющимся лекарственным средствам, выявлением видов грибов, ранее считавшихся непатогенными (около 400 видов грибов - потенциальные возбудители микозов), возросла потребность в эффективных антифунгальных средствах 1. Известно 2, что возбудители поверхностных микозов условно подразделяются на несколько групп, среди которых основными являются патогенные дерматофиты, плесневые грибы и условно-патогенные дрожжеподобные грибы. В соответствии с этим по клиническому применению противогрибковые средства делят на следующие группы 1) препараты для лечения глубоких, системных микозов (в том числе вызываемых плесневыми грибами) 2) препараты для лечения эпидермофитий и трихофитий, вызываемых дерматофитами 3) препараты для лечения кандидозов, вызываемых условно-патогенными дрожжеподобными грибами. Следует подчеркнуть, что спектр действия применяемых в медицинской практике противогрибковых препаратов не охватывает все указанные группы возбудителей микозов, а они проявляют активность лишь в отношении одной или двух неродственных групп грибов. Например, полиеновые препараты (в частности, амфотерицин , нистатин и др.) имеют широкий спектр противогрибковой активности среди антимикотиков, однако к ним обычно устойчивы дерматофиты ( .,.,.). Препараты азолов (кетоконазол, флуконазол, итраконазол и др.) активны при системных или глубоких микозах (кокцидиоидомикоз, паракокцидиомикоз, гистоплазмоз,криптококкоз, бластомикоз), но малоэффективны для лечения эпидермофитий и трихофитий. И наоборот, основными показаниями к назначению аллиламинов (в частности, тербинафина) и гризеофульфина являются именно дерматомикозы, но не кандидомикозы или системные микозы. Таким образом, наличие у противогрибкового средства активности в отношении какой-либо группы возбудителей грибковых заболеваний не является обязательным условием проявления его активности в отношении других групп возбудителей грибковых инфекций. Известны комплексы серебра, проявляющие антимикробные свойства. Среди них наиболее применяемым в медицинской практике средством при лечении ран и ожогов является комплекс серебра с сульфадиазином 3, 4. Существенными недостатками лекарственных средств, содержащих комплекс серебра с сульфадиазином в качестве активной субстанции, является развитие характерных для сульфаниламидных препаратов системных побочных явлений (лейкопении, головной боли, диспепсии), а также жжения,зуда, коричневато-серого окрашивания кожи, кожных аллергических реакций (кожной сыпи, фотосенсибилизации). Кроме того, эти препараты не обладают широким спектром противогрибкового действия 5. Наряду с антибактериальной активностью выявлена умеренная активность комплексов серебра с аминокислотами 6, производными тетразола 7, имидазола 8, салициловой 9, 10, никотиновой 11 и малоновой 12 кислот в отношении дрожжеподобных грибов. Задачей изобретения является разработка новой эффективной субстанции широкого спектра противогрибкового действия для терапии инфекций, вызванных не только дрожжевыми и плесневыми грибами, но и дерматофитами. Поставленная задача достигается применением комплекса серебра с 2-(4,6-ди-третбутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой формулы 2 в качестве антифунгального агента широкого спектра действия, имеющего активность в отношении дерматофитов и характеризующегося низкой токсичностью. Заявляемое соединение было синтезировано авторами и выявлена его антибактериальная активность в отношении ограниченного спектра тест-культур .(АТСС 25922), .( 9027), .( 6633), .(209-), .(коллекция БелГИДУВ) 13. Наряду с этим авторами установлена антифунгальная активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении двух групп возбудителей грибковых заболеваний дрожжевых грибов ( ,,,, ,) и плесневых грибов ( ,.,,.,) 14. В результате расширения спектра тест-культур в фармакологическом скрининге авторами выявлена высокая активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной в отношении еще одной (неродственной указанным выше) группы грибов - дерматофитов ( .,.,.). Данные об антидерматофитной активности этого комплекса серебра отсутствуют. Сущность изобретения иллюстрируется примерами, в которых приведены данные об антифунгальной активности вышеуказанного соединения в отношении различных тесткультур грибов (дрожжевых, плесневых грибов и дерматофитов) и их низкой токсичности. Пример 1. Определение антифунгальной активности комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой проводят методом серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро в отношении следующих тест-культур дерматофитов. -,,, а также. -,. Для этого первое разведение исследуемого вещества готовят в диметилсульфоксиде, а последующие двукратные разведения - в пробирках с жидкой питательной средой. Используются 24-часовые культуры бактерий. Засев бактерий осуществляют путем внесения суспензии бактерий в питательную среду с разной концентрацией исследуемого соединения. Суспензию инкубируют при оптимальной для роста данных бактерий температуре в течение 72 часов. За действующую дозу принимают концентрацию, которая в состоянии задерживать рост культур - минимальную ингибирующую концентрацию Комплекс серебра с 2(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой Нистатин Тербинафин Амфотерицин В Таблица 1 Антифунгальная активность заявляемого вещества в отношении тест-культур грибов дерматофитов МИК, мкг/мл Примечание н/а - активность не обнаружена. Как видно, антифунгальная активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении тест-культур дерматофитов значительно превышает активность широко используемых в медицинской практике антифунгальных антибиотиков - нистатина и амфотерицина , а также сопоставима с активностью стандартного антибиотика тербинафина, характеризующегося специфической антидерматофитной активностью к вышеуказанным тест-культурам. Пример 2. Определение антифунгальной активности комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении тест-культур дрожжевых грибов проводят методом серийных разведений в жидкой питательной среде Сабуро. Для этого первое разведение исследуемого вещества готовят в диметилсульфоксиде, а последующие двукратные разведения - в пробирках с жидкой питательной средой. Используются 24-часовые культуры дрожжей. Засев осуществляют путем внесения суспензии тесткультур в питательную среду с разной концентрацией исследуемого соединения. Суспензию инкубируют при оптимальной для роста дрожжевых грибов температуре в течение 48 ч. Учет результатов проводят визуально по появлению мутности в пробирках и высевом на агаризованную питательную среду. Чувствительность определяют по последней пробирке, в которой отсутствует видимый рост дрожжей. За действующую дозу принимают концентрацию, которая в состоянии задерживать рост тест-культур - минимальную ингибирующую концентрацию (МИК, мкг/мл) (табл. 2). комплекс серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой Нистатин Амфотерицин Таблица 2 Антифунгальная активность заявляемого вещества в отношении тест-культур дрожжевых грибов МИК, мкг/мл Комплекс серебра с 2(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенил-сульфанил)уксусной кислотой Нистатин Тербинафин Амфотерицин Как видно, антифунгальная активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении тест-культур дрожжей сопоставима с активностью стандартных антифунгальных антибиотиков - нистатина и амфотерицина . Пример 3. Определение антифунгальной активности комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении тест-культур плесневых грибов проводят на плотной агаризованной среде. Для исследования антифунгальных свойств испытуемое соединение предварительно растворяют в диметилсульфоксиде и разводят питательной средой до содержания 100 мкг/мл. Для этого исходные концентрированные растворы вносят в плотную агаризованную среду. Антифунгальные свойства оценивают по задержке роста тест-культур. Рассчитывают степень ингибирования радиального роста (100/,где- диаметр колоний грибов в контроле- диаметр колоний грибов в опыте). Результаты испытаний оценивают в трех независимых экспериментах. Антифунгальная активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой приведена в табл. 3 в сравнении с активностью стандартных антифунгальных средств. Таблица 3 Антифунгальная активность заявляемого вещества в отношении тест-культур плесневых грибов 17021 1 2013.04.30 Как видно, антифунгальная активность комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой в отношении большинства тесткультур плесневых грибов превышает активность широко используемых в медицинской практике антифунгальных антибиотиков - нистатина, тербинафина и амфотерицина . Пример 4. Для испытания острой токсичности суспензию комплекса серебра с 2-(4,6-ди-третбутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой готовят растиранием навески субстрата в керамической ступке с добавлением небольшого количества 2,5 крахмального геля. По достижении гомогенности смеси добавляют новые порции крахмального геля, снова растирают, доводят до необходимого объема и тщательно перемешивают. Образовавшуюся пастообразную массу вводят белым беспородным мышам (самцы) массой 25-30 г внутрижелудочно с помощью шприца и зонда, изготовленного из инъекционной иглы. Количество вводимого вещества в пределах одной испытываемой дозы регулируют объемом суспензии пропорционально массе животного. Наблюдение ведут в течение 10 дней, регистрируя признаки отравления и гибель. Признаками интоксикации, проявляющимися вскоре после введения высоких доз комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил 2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой, являются угнетенное общее состояние и глубокое редкое дыхание. Результаты учета гибели животных приведены в табл. 4. Вычисление ЛД 50 выполняют с использованием компьютерной программы. .(1989) 15, основанной на пробит-анализе и взвешенной линейной регрессии. Таблица 4 Гибель животных в зависимости от дозы комплекса серебра с 2-(4,6-ди-третбутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой Количество животных Логарифм Доза, мг/кг Вычислено Пробит дозы всего погибли 4700 3,672098 1 1 0,9851728 7,174677 3000 3,477121 3 3 2,603151 6,115664 2000 3,30103 5 3 2,81627 5,159226 1800 3,255273 4 1 1,85768 4,910694 1600 3,20412 4 1 1,427026 4,632859 1400 3,146128 4 1 0,9903228 4,317877 1000 3,0 6 1 0,4199767 3,524181 800 2,90309 4 0 0,0905308 2,997818 400 2,60206 2 0 0,0007585 1,362777 Вычисленное значение ЛД 50 комплекса серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3 дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой составляет 1869,4 (1470,12377,3) мг/кг (в скобках - доверительный интервал при 95 вероятности). В соответствии с полученными данными и согласно классификации ГОСТ 12.1.007-76, комплекс серебра с 2-(4,6-дитрет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой относится к веществам 5-го класса (малотоксичные вещества, ЛД 501000 мг/кг). Известно 16, что антибиотики, активные в отношении многих групп возбудителей инфекций, обычно слишком токсичны для использования в клинике. Сочетание широкого спектра активности и низкой токсичности является принципиальным для применения этого комплекса серебра в медицинской практике. Таким образом, комплекс серебра с 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой характеризуется широким спектром антифунгальной активности и имеет низкую токсичность. 17021 1 2013.04.30 Источники информации 1..// . - 2004. - . 431. - . 892-893. 2. Харкевич Д.А. Фармакология. - М. Медицина, 1996. - С. 467-470. 3.2 422 688. 4.3 761 590. 5. Машковский М.Д. Средства для лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Лекарственные средства Пособие для врачей. - 14-е изд., испр. и доп. - М., 2001. Гл. 12. - С. 220-372. 6..,. ,-,//(3)22 (2// . . . - 2004. - . 98. - . 13611366. 10...,// . . . - 1995. - . 58. - . 255- 267. 11...2-,// . . . . - 2000. - . 73. - . 1143-1152. 12...,// . - 1995. - . 14. - . 1359-1367. 13. Чернявская А.А. и др. Синтез и антимикробная активность комплексов серебраи медис 2-(4,6-ди-трет-бутил-2,3-дигидроксифенилсульфанил)уксусной кислотой // Хим.-фарм. журн. - 2006. - Т. 40. -8. - С. 7-9. 14. Логинова Н.В. и др. Биоактивные металлокомплексы производных пространственно экранированных дифенолов и аминофенолов - новое направление для создания антимикробных и антивирусных средств // Вести. Белорус. гос. ун-та. Сер. 2. Химия, Биология,География. - 2006. -3. - С. 3-20. 15.5050 // . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7