Способ выделения высокоочищенных изохинолиновых алкалоидов из корней чистотела большого (Chelidonium majus L.)

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННЫХ ИЗОХИНОЛИНОВЫХ АЛКАЛОИДОВ ИЗ КОРНЕЙ ЧИСТОТЕЛА БОЛЬШОГО (.)(71) Заявители Зверинский Игорь Владимирович Мельниченко Наталья Георгиевна(72) Авторы Зверинский Игорь Владимирович Мельниченко Наталья Георгиевна(73) Патентообладатели Зверинский Игорь Владимирович Мельниченко Наталья Георгиевна(57) Способ выделения высокоочищенных изохинолиновых алкалоидов из корней чистотела большого ( ма .), при котором измельченную корневую часть чистотела заливают 70 -ным этиловым спиртом в соотношении на 1 кг корней 5 литров спирта, настаивают в течение 120 минут при температуре 50 С и экспозиции ультразвука с частотой ультразвуковых колебаний 24 кГц, затем фильтруют под вакуумом, с помощью ротационного испарителя отгоняют спирт под вакуумом при температуре 60 С до образования густого темно-коричневого остатка, к остатку приливают около 500 мл 1 -ного водного раствора соляной кислоты и в течение 30 минут при постоянном перемешивании при температуре 60 С производят экстракцию алкалоидов, после чего раствор сливают,14106 1 2011.02.28 добавляют к нему тальк до 2 содержания, хорошо перемешивают, резко охлаждают и затем центрифугируют, надосадочный раствор сливают и фильтруют под вакуумом, полученный фильтрат подщелачивают 25 -ным раствором аммиака до 9-11, хорошо перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 1/3 от исходного объема раствора и проводят экстракцию оснований алкалоидов в течение 30 минут, после чего отделяют хлороформ,добавляют к нему 1 -ный водный раствор соляной кислоты в соотношении 11 и в течение 30 минут при постоянном перемешивании и температуре 40 С производят перевод оснований алкалоидов в гидрохлориды, после чего кислотный слой сливают, нагревают его до полного растворения осадка, вносят активированный уголь, перемешивают в течение 5 минут и фильтруют под вакуумом, полученный фильтрат подвергают повторной экстракции хлороформом с последующим резким охлаждением, выдерживают 60 минут,образовавшийся аморфный осадок алкалоидов чистотела ярко-оранжевого цвета фильтруют под вакуумом, а затем высушивают при 40 С под вакуумом в течение 2-4 часов. Изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической промышленности, и позволяет выделять общую фракцию алкалоидов чистотела с высокой степенью очистки из растительного сырья..,- чистотел большой семейства маковых - известное лекарственное растение, обладает разносторонней фармакологической активностью, что обусловлено присутствием алкалоидов группы изохинолина 7. В фармакологическом аспекте чистотел является хорошо изученным лекарственным растением. При этом следует отметить, что внимание фармакологов сосредоточено на суммарных галеновых, новогаленовых и комбинированных препаратах чистотела. В то же время применение отдельных алкалоидов чистотела в виде лекарственных препаратов пока не нашло широкого применения, несмотря на высокий терапевтический потенциал их и многочисленные исследования, это подтверждающие 8, 11, 14, 15, 20, 23, 24, 25, 26. Так,хелидонин оказывает выраженное болеутоляющее, успокаивающее и спазмолитическое действие 4. Группа протопина обладает противоаритмическим действием, превосходящим такие соединения, как цинхонидин и новокаинамид 1. Берберин, хелеритрин и сангвинарин обладают выраженными антибактериальными, противогрибковыми и антивирусными свойствами 2, 9, 10, 13, 17, 18, 21. На основе алкалоидов чистотела созданы полусинтетические противораковые и противовирусные препараты -и Амитозин 19, 22. Разработка новых методов выделения алкалоидов из чистотела является одним из приоритетных направлений в области фармакологии для создания новых лекарственных препаратов. Основная задача процесса выделения алкалоидов из растительного сырья - это эффективная экстракция и отделение примесей (балластных веществ). Основную массу балласта составляют клетчатка и другие полисахариды, а также вещества смолистого и коллоидного характера. Известен способ извлечения гидрохлоридов хелеритрина и сангвинарина из сангвинарии канадской ( ) путем экстракции корневой части растения водным раствором метанола, предварительно подкисленным соляной кислотой, с последующим осаждением алкалоидов солями цинка и растворением осадка в лимонной кислоте, фильтрацией и преципитацией алкалоидов натрий хлором 6. Недостатками способа являются недостаточная очистка алкалоидов от нежелательных примесей и использование на начальном этапе токсического экстрагента - метанола. Известен способ извлечения суммы солей хелеритрина и сангвинарина с использованием в качестве экстрагента подщелоченного раствора водного метанола, с последующей 2 14106 1 2011.02.28 обработкой экстракта хлористым метиленом, экстракцией алкалоидов из хлористого метилена водным раствором лимонной кислоты и преципитацией гидрохлоридов алкалоидов хлористым натрием 5. Недостатками способа также являются недостаточная очистка алкалоидов от нежелательных примесей и использование на начальном этапе метанола. Известен способ получения гидрохлоридов хелеритрина и сангвинарина из маклеи сердцевидной ( ) экстракцией подщелоченным раствором метанола, охлаждением, фильтрацией, сушкой полупродукта, растворением последнего в соляной кислоте и сушкой 12. Недостатками способа являются недостаточная очистка алкалоидов от нежелательных примесей и использование на начальном этапе токсического экстрагента - метанола. Наиболее близким способом к заявляемому является способ извлечения общей фракции алкалоидов из чистотела большого (.), разработанный сотрудниками Львовского химико-фармацевтического завода 3. В качестве органического растворителя используется ацетон, подкисленный 5 -ной уксусной кислотой. Экстрагирование проводится методом перколяции. Настаивание в каждом перколяторе (3) длится 8 ч. После отгонки ацетона водный остаток выдерживают при температуре 2-3 С,10-12 ч для осаждения смол. Водный раствор переливают в новую емкость (без фильтрации) и подщелачивают концентрированным водным раствором аммиака до 10-11. Основание алкалоидов извлекаются двойной экстракцией хлороформом. Хлороформенные извлечения выдерживают 8-10 ч, отделяют водную фазу, а затем выпаривают хлороформ до объема 40-50 мл. К остаткам хлороформа доливают 10 -ный водный раствор соляной кислоты до 3,0 и выпаривают остатки хлороформа. Водный раствор охлаждают (выпадение алкалоидов) и фильтруют. Основными недостатками этого способа выделения являются большая продолжительность выделения, использование ацетона как экстрагента и недостаточная очистка от сопутствующих примесей продукта. Задачей настоящего изобретения является разработка быстрого, эффективного и нетрудоемкого метода выделения высокоочищенной общей фракции алкалоидов чистотела большого из корневой части растительного сырья. Поставленная задача решается путем осуществления двойной экстракции хлороформом, при этом отличительным моментом является то, что измельченную корневую часть чистотела заливают 70 -ным этиловым спиртом в соотношении 1 кг корней на 5 л спирта и настаивают в течение 120 мин при экспозиции ультразвука с частотой ультразвуковых колебаний 24 кГц и температуре 50, затем фильтруют под вакуумом, с помощью ротационного испарителя отгоняют спирт под вакуумом при температуре 60 С до образования густого темно-коричневого остатка, к остатку приливают около 500 мл 1 -ной соляной кислоты и в течение 30 мин при температуре 60 С при постоянном перемешивании производят экстракцию алкалоидов, после чего раствор сливают, добавляют тальк до 2 содержания, хорошо перемешивают, резко охлаждают и затем центрифугируют,надосадочный раствор сливают и фильтруют под вакуумом, полученный фильтрат подщелачивают 25 -ным раствором аммиака до 9-11, хорошо перемешивают, добавляют хлороформ из расчета 1/3 от исходного объема раствора и проводят экстракцию оснований алкалоидов в течение 30 мин, после чего отделяют хлороформ, добавляют к нему 1 ный водный раствор соляной кислоты в соотношении 11 и в течение 30 мин при постоянном перемешивании и температуре 40 С производят перевод оснований алкалоидов в гидрохлориды, после чего кислотный слой сливают, нагревают его до полного растворения осадка, вносят активированный уголь, перемешивают в течение 5 минут и фильтруют под вакуумом, полученный фильтрат подвергают повторной экстракции хлороформом с последующим резким охлаждением, выдерживают 60 мин, образовавшийся аморфный 14106 1 2011.02.28 осадок алкалоидов чистотела ярко-оранжевого цвета фильтруют под вакуумом, а затем высушивают при 40 С под вакуумом в течение 2-4 ч. На фигуре представлена схема выделения алкалоидов из корней чистотела большого. Способ осуществляют следующим образом. Высушенные и измельченные до размера 40/60 корни чистотела заливают 70 -ным этиловым спиртом в соотношении 1 кг корней на 5 л спирта и настаивают в течение 120 мин при экспозиции ультразвука с частотой ультразвуковых колебаний 24 кГц и температуре 50 С. Затем фильтруют под вакуумом через фильтровальную бумагу марки Ф ГОСТ 12026-76. После фильтрации производят отгонку спирта ротационным испарителем под вакуумом при температуре 60 С до образования густого темно-коричневого остатка. К осадку после отгонки спирта приливают около 500 мл 1 -ной соляной кислоты и в течение 30 мин при температуре 60 С при постоянном перемешивании производят экстракцию алкалоидов из смол. Затем раствор сливают, добавляют тальк до 2 содержания (тальк необходим для связывания смол), хорошо перемешивают, охлаждают, при этом происходит выпадение смол, и затем центрифугируют. Надосадочный раствор сливают и фильтруют. В качестве фильтра используют фильтровальную бумагу марки Ф ГОСТ 12026-76, фильтрацию осуществляют под вакуумом. Полученный фильтрат подщелачивают 25 -ным аммиачным раствором до 9-11, хорошо перемешивают, при этом часть оснований алкалоидов выпадает в виде обильного желто-коричневого хлопьевидного осадка, добавляют хлороформ из расчета 1/3 от исходного объема раствора. Экстракцию оснований алкалоидов проводят в течение 30 мин, после чего отделяют хлороформ с использованием делительной воронки. К хлороформу добавляют 1 -ную соляную кислоту в соотношении 11 и в течение 30 мин при постоянном перемешивании и температуре 40 С производят перевод оснований алкалоидов в гидрохлориды, которые концентрируются в кислоте из-за неспособности растворяться в хлороформе, так называемая кислотная ловушка. В то же время нежелательные полярные примеси остаются в хлороформе, и таким образом происходит очистка от балластных веществ, особенно смолистого характера. После этого сливают кислоту. Кислоту нагревают до полного растворения осадка, вносят активированный уголь марки -320,перемешивают в течение 5 минут и фильтруют под вакуумом. Полученный фильтрат подвергают повторной экстракции, в результате чего образуется обильный аморфный осадок алкалоидов (гидрохлоридов) чистотела ярко-оранжевого цвета. Время осаждения - 60 мин. Осадок алкалоидов чистотела фильтруют под вакуумом, а затем высушивают при 40 С под вакуумом в течение 2-4 ч. Использование ультразвука для экстракции имеет следующие преимущества ультразвук ускоряет процесс экстрагирования сырья, обеспечивая более полное извлечение нужных веществ ультразвуковые волны создают колебания давления, кавитацию и акустические течения, в результате быстрее происходит набухание материала и растворение содержимого клетки, увеличивается скорость обтекания частиц сырья, в пограничном диффузионном слое возникают турбулентные и вихревые потоки молекулярная диффузия внутри частиц материала и в пограничном диффузионном слое практически заменяется конвективной, что приводит к интенсификации массообмена, в результате кавитации происходит разрушение клеточных структур, что ускоряет процесс перехода полезных веществ в экстрагент за счет их вымывания. Для очистки алкалоидов нами были выбраны следующие марки активированного угля -320 и 520. Это высокоактивные, высококачественные порошковые активированные угли, специально разработанные для обесцвечивания и очистки пищевых добавок,фармацевтических препаратов и антибиотиков. Могут использоваться в кислой, нейтральной и щелочной среде. Все дозы, пропорции, температурные и вакуумные режимы были разработаны нами экспериментальным путем. 4 14106 1 2011.02.28 Изобретение иллюстрируется следующим примерами. Пример 1. Высушенные и измельченные корни чистотела, собранного в зоне лесопарка Пышки(г. Гродно) во время цветения, заливают 70 -ным этиловым спиртом в соотношении 1 кг корней 5 л спирта и проводят экстракцию в течение 120 мин, при температуре 50 С и экспозиции ультразвука. После экстракции спирт сливается и фильтруется под вакуумом. Отгоняется спирт под вакуумом до образования темно-коричневого остатка. К остатку добавляется около 500 мл 1 -нойи в течение 30 мин при температуре 60 С перемешивается. Сливается раствор, добавляется тальк, охлаждается и центрифугируется при 2000 оборотов/мин в течение 15 мин. Надосадочный раствор фильтруется под вакуумом. Фильтрат подщелачиваем 25 -ным раствором аммиака до 9-11, при этом часть алкалоидов чистотела выпадает в виде обильного желто-коричневого хлопьевидного осадка. Основания алкалоидов извлекаются экстракцией хлороформом в течение 30 мин. Хлороформ сливается с использованием делительной воронки, и добавляется к хлороформу 1 -ный водный раствор соляной кислоты в соотношении 11 (объем/объем), и в течение 30 мин при температуре 40 С и постоянном встряхивании производится перевод оснований алкалоидов в гидрохлориды, при этом на границе фаз растворителей часто образуется ярко-оранжевый алкалоидный осадок. Кислота сливается, нагревается до полного растворения осадка. Добавляется к раствору активированный уголь марки -320 в соотношении 1 г активированного угля на 1 л раствора, перемешивается в течение 5 мин и фильтруется под вакуумом. Раствор охлаждается. Полученный фильтрат подвергают повторной экстракции хлороформом с последующим резким охлаждением (ледяная баня). Через 60 мин образуется обильный ярко-оранжевый аморфный осадок, общая фракция гидрохлоридов алкалоидов чистотела. Осадок фильтруется, сушится в течение 2-4 ч под вакуумом и измельчается. Общий вес суммы алкалоидов чистотела из 1 кг сухих корней лесного чистотела составляет 2,274 г или 0,2274 . Пример 2. Высушенные и измельченные корни культивируемого чистотела заливают 70 -ным этиловым спиртом в соотношении 1 кг корней 5 л спирта и проводят экстракцию в течение 120 мин, при температуре 50 С и экспозиции ультразвука. После экстракции спирт сливают и фильтруют под вакуумом. Отгоняют спирт под вакуумом до образования темно-коричневого остатка. К остатку добавляют около 500 мл 1 -ного водного раствора соляной кислоты и в течение 30 мин при температуре 60 С производят растворение экстракта. Сливают раствор, добавляют тальк, охлаждают и центрифугируют при 2000 оборотов/мин в течение 15 мин. Надосадочный раствор фильтруют под вакуумом. Фильтрат подщелачивают 25 -ным раствором аммиака до 9-11, при этом часть алкалоидов чистотела выпадает в виде обильного желто-коричневого хлопьевидного осадка. Основания алкалоидов извлекаются экстракцией хлороформом в течение 30 мин. Хлороформ сливается с использованием делительной воронки, и добавляется к хлороформу 1 -ный водный раствор соляной кислоты в соотношении 11 (объем/объем), и в течение 30 мин при температуре 40 С и постоянном встряхивании производится перевод оснований алкалоидов в гидрохлориды, при этом на границе фаз растворителей часто образуется ярко-оранжевый алкалоидный осадок. Кислота сливается, нагревается до полного растворения осадка. Добавляется к раствору активированный уголь марки -320 в соотношении 1 г активированного угля на 1 л раствора, перемешивается в течение 5 мин и фильтруется под вакуумом. Раствор охлаждается. Полученный фильтрат подвергают повторной экстракции хлороформом с последующим резким охлаждением (ледяная баня). Через 60 мин образуется обильный ярко-оранжевый аморфный осадок, общая фракция гидрохлоридов алкалоидов чистотела. Осадок фильтруется, сушится в течение 2-4 ч под вакуумом и измельчается. Общий вес суммы алкалоидов чистотела из 1 кг сухих корней культивируемого чистотела составил 8,982 г или 0,892 . Степень чистоты фракции алкалоидов 95-97 . 5 14106 1 2011.02.28 Таким образом, с помощью заявляемого способа действительно можно получать алкалоиды чистотела из растительного сырья, причем значительно повышена степень их очистки (без дополнительной очистки), сокращено время процесса извлечения. Метод позволяет использовать растительное сырье для получения продукта с низким содержанием алкалоидов (менее 0,4 ). Источники информации 1. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. - М. Наука, 1990. - 333 с. 2. Новикова Л.С., Данилова Л.Г., Швагер Н.Я., Закарян Л.М. Изучение антимикробной активности суммы алкалоидов и препаратов чистотела большого. - М. Фармация, 1979. С. 54-56. 3. А. с. СССР 495311, МПК 0743/30, 1975. 4. Соболева В.А., Клименко Л.Ю. Сравнительный анализ применения чистотела большого в научной, народной и гомеопатической медицине // Провизор. - 2001. -17. 5. Патент США 4 818 533 6.Патент США 4 769 452. 7.,..//. - 1996. - . 33. - . 2. - . 127-134. 8.,,//. - 2004. - .317. - . 2. - . 618-624. 9.,,,,.,.,.,// . - 2003. - . 46. - . 1-2. - . 29-37. 10.,.,.,.,.,.,.,// . - 2003. - . 74. - . 7-8. - . 702-705. 11..,.,.,.,.,.,//. - 1999. - . 63. - . 9. - . 557-562. 12. Патент США 5 133 981. 13..,.,.,.,.,.,.// . - 2007. - . 78. . 2. - . 159-161. 14.,,,,,,,, ,,Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7