Способ оценки состояния Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства после лапароскопической холецистэктомии

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА В ЗОНЕ ОПЕРАТИВНОГО ВМЕШАТЕЛЬСТВА ПОСЛЕ ЛАПАРОСКОПИЧЕСКОЙ ХОЛЕЦИСТЭКТОМИИ(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Гарелик Петр Васильевич Могилевец Эдуард Владиславович Шейбак Владимир Михайлович Мороз Валентина Леопольдовна Горецкая Марианна Викторовна(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(56) СМОТРИН С.М. Хирургическая рана оценка течения, прогнозирование и оптимизация заживления, профилактика гнойных осложнений в неотложной хирургии Автореферат диссертации. - Гродно, 2004. - . 19-20. СМОТРИН С.М. Хирургическая рана прогнозирование и оптимизация заживления. - Гродно, 2005. - . 34-38. МОГИЛЕВЕЦ Э.В. и др. // Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя медыцынскх навук. - 2006,5. . 52-54.(57) Способ оценки состояния Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства после лапароскопической холецистэктомии, отличающийся тем, что в жидкости из подпеченочного пространства, полученной через 24 часа после операции по дренажу, установленному в зоне оперативного вмешательства, определяют содержание лимфоцитов 4, 8, 16 и иммунорегуляторный индекс 4/8 и при содержании лимфоцитов 4(311,48) , лимфоцитов 16(28,24,63)и значении индекса 4/8 Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, и может применяться для оценки состояния Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства после лапароскопической холецистэктомии (ЛХЭ). В настоящее время важная роль придается состоянию иммунореактивности организма при хирургических заболеваниях билиарной системы. Многими авторами показано, что еще до операции в иммунной системе больных желчнокаменной болезнью имеются существенные нарушения, а хирургическая агрессия и наркоз являются причиной срыва неустойчивого равновесия параметров противоинфекционной защиты. При наличии в организме очага хронической либо острой инфекции характеристики иммунокомпетент 12194 1 2009.08.30 ных клеток и иммунологических молекул в нем могут значительно отличаться от характеристик тех же типов клеток и молекул, циркулирующих в крови. Таким образом, существует необходимость в оценке Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства после ЛХЭ. Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки состояния иммунитета в содержимом кожно-вакуумных пузырей, образованных путем отслойки эпидермиса от дермы с применением специальной камеры (Смотрин С.М. Хирургическая рана оценка течения, прогнозирование и оптимизация заживления, профилактика гнойных осложнений в неотложной хирургии автореф.дис. докт. мед. наук 14.00.27 / С.М. Смотрин Гродненский государственный медицинский университет. - Гродно, 2004. - 43 с). В содержимом подсчитывают абсолютное количество лейкоцитов и определяют содержание нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов в 1 мм 3 забранной пробы раневого экссудата. Дополнительно определяют содержание Т-лимфоцитов (3), Т-хелперов (4) и Тсупрессоров (8), рассчитывают иммунорегуляторный индекс (4/8). Недостатком этого способа является то. что за счет эффекта отвлекания (ухода иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления) не отражаются процессы, происходящие непосредственно в послеоперационной зоне, то есть он недостаточно чувствителен для оценки местного иммунитета, течения репаративного процесса и не отражает зависимость от особенностей операции и других факторов, кроме того, требуется наличие специальных устройств (камеры для создания кожно-вакуумных пузырей), происходит травматизация кожных покровов. Задачей изобретения является разработка более чувствительного способа оценки состояния местного иммунитета. Поставленная задача решается путем определения содержания лимфоцитов 3, 4,8, 16 и иммунорегуляторного индекса 4/8 в раневом экссудате. Отличительным моментом является то, что данные показатели определяют в жидкости из подпеченочного пространства, полученной через 24 часа после операции по дренажу,установленному в зоне оперативного вмешательства, и при содержании лимфоцитов С 4(311,48) , лимфоцитов С 16(28,24,63) , С 4/С 8(1,030,07) диагностируют дисфункцию Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства. Способ осуществляют следующим образом. У пациентов после ЛХЭ по дренажу через 24 часа после операции получают отделяемое из подпеченочного пространства, являющееся раневым экссудатом, и в нем проводят иммунофенотипирование лимфоцитов, определяют гемолитическую активность комплемента,уровни циркулирующих иммунных комплексов, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. При содержании лимфоцитов 4(311,48) , лимфоцитов 16(28,24,63) ,4/8(1,030,07) диагностируют дисфункцию местного иммунитета. Исследование перитонеальной жидкости проводят через 24 часа в связи с тем, что к этому времени развиваются статистически значимые изменения, а позднее дренаж удаляют. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили в тестах розеткообразования с частицами, покрытыми моноклональными антителами против кластеров дифференциации 3, 4, 8, 16, 19, 25, 95. Гемолитическую активность комплемента измеряли по титру - наибольшему разведению сыворотки, обеспечивающей 50 гемолиз в созданной гемолитической системе с 3-5 -й взвесью эритроцитов барана. Уровни циркулирующих иммунных комплексов определяли методом преципитации с 3,5 -м раствором полиэтиленгликоля. Функциональную активность нейтрофилов оценивали определением фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса нейтрофилов с культурой золотистого стафилококка. Данные были обработаны статистически с использованием пакета программ 6.0. Приводим доказательства возможности осуществления способа. 12194 1 2009.08.30 Под наблюдением находилось 60 пациентов после лапароскопической холецистэктомии в возрасте от 23 до 74 лет. Средний возраст составил 51,41,51 года. От 21 до 40 лет было 8 (13 ) пациентов, от 41 до 60 лет - 37 (62 ), старше 60 лет - 15 (25 ). Мужчин было 8 (13 ), женщин - 52 (87 ). Хронический калькулезный холецистит диагностирован у 45 (75 ), острый - у 15 (25 ). Средняя длительность заболевания желчнокаменной болезнью составила 3,950,65 лет. До операции проводились стандартные общеклинические лабораторные и инструментальные исследования. Всем пациентам выполнялась лапароскопическая холецистэктомия под эндотрахеальным наркозом. В подпеченочное пространство устанавливался тонкий дренаж. В венозной крови с гепарином (20 единиц на 1 мл крови) перед операцией, а также на первые сутки после нее проводилось иммунофенотипирование лимфоцитов, измерялась гемолитическая активность комплемента, определялись уровни циркулирующих иммунных комплексов, а также изучалась функциональная активность нейтрофилов. В жидкости, полученной по дренажу из подпеченочного пространства через 24 часа после операции, проводили иммунофенотипирование лимфоцитов, определяли гемолитическую активность комплемента, уровни циркулирующих иммунных комплексов, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. Продолжительность лапароскопической холецистэктомии в среднем составила 76,64,74 мин. В 19 случаях во время лапароскопической холецистэктомии отмечены технические трудности. Причиной этого явилось в 2 (3 ) случаях глубокое расположение желчного пузыря в печени, в 5 (8 ) - склероатрофический фарфоровый желчный пузырь, в 3 (5 ) - остаточные явления стихающего острого холецистита, воспалительный инфильтрат, создававший трудности как на этапе диссекции в области треугольника Кало,так и при отделении желчного пузыря от его ложа. В этой группе больных длительность операции составила 87,610,13 мин. Дополнительный гемостаз ложа с помощью монополярной коагуляции понадобился в 9 (15 ) случаях. В среднем количество отделяемого в послеоперационном периоде по дренажу из подпеченочного пространства составило 58,21,79 мл, причем в группе с техническими трудностями и дополнительным гемостазом во время операции - 75,0170 мл, а в группе больных с типично протекавшим оперативным вмешательством - 49,75,69 мл (р 0,001). В венозной крови до лапароскопической холецистэктомии и через 24 часа после нее изучены показатели клеточного иммунитета (табл. 1). Таблица 1 Показатели клеточного иммунитета в крови до и после ЛХЭ Показатель Нейтрофилы,Нейтрофилы,109/л Лимфоциты,Лимфоциты,109/л С 3,С 3,109/л С 4,С 4,109/л С 8,С 8,109/л С 4 / С 8 С 19,С 19,109/л С 16,12194 1 2009.08.30 Показатель С 16,109/л С 25,С 25,109/л С 95,С 95,109/л Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс Таким образом, в крови после операции отмечается повышение содержания нейтрофилов на 80,88 и абсолютного количества лимфоцитов на 40 , а также снижение процентного содержания и абсолютного количества С 3-лимфоцитов наряду с тенденцией к снижению процентного содержания лимфоцитов на фоне низких значений до операции. Статистически значимых различий в иммунограмме крови в группах травматичных и нетравматичных оперативных вмешательств не выявлено. Непосредственно в очаге воспаления, которым в данном случае является зона оперативного вмешательства, были исследованы показатели клеточного звена иммунитета в жидкости, полученной по дренажу из подпеченочного пространства через 24 часа после операции, приведенные в табл. 2. Таблица 2 Показатели клеточного иммунитета в перитонеальном отделяемом после ЛХЭ Показатель М Нейтрофилы,75,63,50 5,622,269 Нейтрофилы,109/л Лимфоциты,10,81,32 9 0,5500,1548 Лимфоциты,10 /л С 3,44,52,79 9 0,2890,0962 С 3,10 /л С 4,36,62,55 9 0,3180,0884 С 4,10 /л С 8,34,72,44 9 0,2540,0833 С 8,10 /л С 4/ С 8 1,240,054 С 19,26,42,03 0,2450,0884 С 19,109/л С 16,38,22,87 9 0,2670,0728 С 16,10 /л СД 25,20,32,46 0,2150,0999 С 25,109/л С 95,49,23,85 9 0,2880,1021 С 95,10 /л Фагоцитарное число 50,732,707 Фагоцитарный индекс 6,530,313 При сравнении данных показателей в группах острого и хронического холецистита выявлено статистически значимое различие в процентном содержании С 16-лимфоцитов 23,53,48 при остром холецистите и 41,42,93 при хроническом (0,0073), С 954 12194 1 2009.08.30 лимфоцитов 32,52,5 при остром холецистите и 52,93,61 при хроническом (0,0339),а также коэффициента С 4/С 8 0,9 при остром холецистите и 1,3 при хроническом(0,0128). В табл. 3 приведены показатели клеточного звена иммунитета в жидкости, полученной по дренажу из подпеченочного пространства через 24 часа после операции, в группах травматичных и нетравматичных оперативных вмешательств. Таблица 3 Показатели клеточного иммунитета в перитонеальном отделяемом после ЛХЭ в группах травматичных и нетравматичных оперативных вмешательств травматичные нетравматичные Нейтрофилы,80,52,5 69,54,55 0,1913 9 6,354,01 4,162,58 0,6582 Нейтрофилы,10 /л Лимфоциты,10,00,47 17,256,14 0,4754 9 0,7750,0,475 0,6130,183 0,7056 Лимфоциты,10 /л С 3,423,77 48,43,75 0,3454 9 0,3230,215 0,3740,137 0,8456 С 3,10 /л С 4,311,48 443,74 0,0363 9 0,2070,105 0,3730,121 0,4385 С 4,10 /л С 8,26,92,61 313,83 0,5044 9 0,2260,136 0,2670,119 0,8450 С 8,10 /л С 4/С 8 1,030,07 1,630,166 0,0324 С 19,30,34,24 33,23,27 0,6217 9 0,2380,112 0,250,148 0,9577 С 19.10 /л С 16,28,24,63 41,93,13 0,0290 9 0,2250,073 0,2780,093 0,8144 С 16,10 /л С 25,23,65,85 29,14,02 0,4432 9 0,1230,051 0,2760,166 0,5342 С 25,10 /л С 95,44,27,41 38,84,7 0,5469 9 0,2760,162 0,2960,161 0,9389 С 95,10 /л Фагоцитарное число 55,149,15 56,212,003 0,8612 Фагоцитарный индекс 7,290,835 7,020,387 0,8254 Таким образом, при значении показателей в отделяемом из подпеченочного пространства С 4-лимфоцитов 311,48 , С 4/С 81,030,07, С 16-лимфоцитов 28,24,63 считаем оперативное вмешательство вызывающим дисфункцию Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства. При проведении корреляционного анализа показателей клеточного звена иммунитета в крови после операции и в жидкости из подпеченочного пространства выявлены следующие зависимости одноименных показателей абсолютного количества лимфоцитов (-0,999,0,019), С 25-лимфоцитов (-0,999,0,014) и процентного содержания С 95 лимфоцитов (-0,999,0,014). Остальные показатели не коррелировали друг с другом,что может свидетельствовать о недостаточной информативности показателей общего иммунитета для характеристики процессов, происходящих непосредственно в зоне воспаления, что может быть объяснено миграцией иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления,а также отграничением очага. Это обуславливает необходимость тестирования показателей иммунитета в средах, максимально приближенных к патологическому очагу. Уровень ЦИК и общая активность комплемента в крови до и после операции существенно не изменились (табл. 4). Показатель 12194 1 2009.08.30 Таблица 4 Уровень ЦИК и общая активность комплемента до и после ЛХЭ до операции после операции ЦИК, ед 20,73,45 19,12,43 0,3114 Комплемент, 2 2,290,23 2,550,227 0,0679 Комплемент, 50 43,483,256 44,883,506 0,0755 Для оценки функционирования гуморального звена иммунитета в зоне оперативного вмешательства была исследована жидкость, полученная по дренажу из подпеченочного пространства через 24 часа после операции. Уровень ЦИК составил 15,43,84 ед, общая активность комплемента - 1,440,1 Приводим примеры, подтверждающие возможность осуществления способа. Пример 1 Больная Ж., 59 лет, история болезни 2838. Диагноз ЖКБ, острый калькулезный холецистит. Хронический гастрит. ИБС очаговый и диффузный кардиосклероз. Артериальная гипертензия , риск 4. Хронический пиелонефрит. Доставлена бригадой скорой помощи. При поступлении предъявляла жалобы на периодические боли в правом подреберье, тяжесть в эпигастральной области, тошноту, однократную рвоту. Желчнокаменной болезнью страдает 2 года. Проведено полное клиническое и лабораторное обследование. Больной выполнена лапароскопическая холецистэктомия под эндотрахеальным наркозом. Пневмоперитонеум накладывался с помощью троакара над пупком. Остальные троакары вводили в стандартных точках РедикаОлсена. Монополярный режим коагуляции электрохирургического блока использовали на этапе отделения ЖП от паренхимы печени. В подпеченочное пространство был установлен тонкий дренаж. Общая длительность операции составила 1 час. Перед операцией, а также на 1-е сутки после операции в венозной крови и в отделяемом из подпеченочного пространства, полученном по дренажу через 24 часа после операции, проводилось иммунофенотипирование лимфоцитов (3, 4, 8, 16, 19,25, 95), определялись гемолитическая активность комплемента, уровни циркулирующих иммунных комплексов, функциональная активность нейтрофилов, включающая определение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса. Данные до операции иммунограмма содержание нейтрофилов 60 , содержание лимфоцитов 29 , 3 лимфоцитов 30 , 4-лимфоцитов 14 , 8-лимфоцитов 9 , 4/8 1,6, 16 лимфоцитов 12 , 19-лимфоцитов 6 , 25-лимфоцитов 12 , 95-лимфоцитов 22 , фагоцитарное число 73, фагоцитарный индекс 8,3, уровень ЦИК 19 ед, гемолитическая активность комплемента 2. Данные на 1-е сутки после операции иммунограмма содержание лимфоцитов 23 , 3-лимфоцитов 20 , 4-лимфоцитов 15 , 8-лимфоцитов 14 , 4/8 1,1, 16-лимфоцитов 20 , 19-лимфоцитов 12 , 25-лимфоцитов 17 , 95-лимфоцитов 31 , фагоцитарное число 58, фагоцитарный индекс 7,7, уровень ЦИК20 ед, гемолитическая активность комплемента 2,5. Данные анализа отделяемого из подпеченочного пространства содержание лимфоцитов 33 , 3-лимфоцитов 27 , 4-лимфоцитов 26 , 8-лимфоцитов 27 ,4/8 1, 16-лимфоцитов 17 , 19-лимфоцитов 20 , 25-лимфоцитов 7 ,95-лимфоцитов 35 , фагоцитарное число 47, фагоцитарный индекс 5,7, уровень ЦИК 19 ед, гемолитическая активность комплемента 1. Таким образом, в зоне оперативного вмешательства определяется дисфункция Т-клеточного иммунитета со снижением процентного содержания 4-лимфоцитов,16-лимфоцитов и коэффициента 4/8. Показатель 12194 1 2009.08.30 Пример 2 Больной Г., 38 лет, история болезни 3262. Диагноз ЖКБ, хронический калькулезный холецистит. Поступил для планового оперативного лечения. При поступлении предъявлял жалобы на тяжесть в правом подреберье, горечь во рту. Желчекаменной болезнью страдает 4 месяца. Проведено полное клиническое и лабораторное обследование. Выполнена лапароскопическая холецистэктомия под эндотрахеальным наркозом. Пневмоперитонеум накладывался с помощью троакара над пупком. Остальные троакары вводили в стандартных точках Редика-Олсена. Монополярный режим коагуляции электрохирургического блока использовали на этапе отделения желчного пузыря от паренхимы печени. В подпеченочное пространство был установлен тонкий дренаж. Общая длительность операции составила 50 минут. Перед операцией, а также на 1-е сутки после операции в венозной крови и в отделяемом из подпеченочного пространства, полученном по дренажу через 24 часа после операции, проводилось иммунофенотипирование лимфоцитов (3, 4, 8, 16, 19,25, 95), определялись гемолитическая активность комплемента, уровни циркулирующих иммунных комплексов, функциональная активность нейтрофилов, включающая определение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса. Данные до операции иммунограмма содержание нейтрофилов 54 , содержание лимфоцитов 35 , С 3 лимфоцитов 20 , 4-лимфоцитов 24 , 8-лимфоцитов 10 , 4/8 2,4, 19 лимфоцитов 18 , 16-лимфоцитов 24 , 25-лимфоцитов 15 , 95-лимфоцитов 20 , фагоцитарное число 62, фагоцитарный индекс 6,7, уровень ЦИК 18 ед., гемолитическая активность комплемента 1,5. Данные на 1-е сутки после операции иммунограмма содержание нейтрофилов 67 , лимфоцитов 27 , 3-лимфоцитов 17 , 4-лимфоцитов 13 , 8-лимфоцитов 14 , 4/8 0,9, 16-лимфоцитов 10 , 19-лимфоцитов 18 , 25-лимфоцитов 15 , 95-лимфоцитов 12 , фагоцитарное число 59, фагоцитарный индекс 8,9, уровень ЦИК 22 ед., гемолитическая активность комплемента 2. Данные анализа отделяемого из подпеченочного пространства содержание лимфоцитов 36 , содержание 3-лимфоцитов 39 , 4-лимфоцитов 35 , 8-лимфоцитов 24 , 4/8 1,5, 16-лимфоцитов 36 , 19-лимфоцитов 34 , 25-лимфоцитов 23 , 95-лимфоцитов 25 , фагоцитарное число 53, фагоцитарный индекс 6, уровень ЦИК 14 ед., гемолитическая активность комплемента 2,5. Таким образом, в зоне оперативного вмешательства не отмечается дисфункции Т-клеточного иммунитета. Из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ доступен, прост в исполнении и действительно позволяет более точно оценить состояние Т-клеточного иммунитета в зоне оперативного вмешательства после ЛХЭ. Таким образом, предлагаемый способ является более чувствительным по сравнению с прототипом в связи с тестированием показателей непосредственно в зоне оперативного вмешательства и существенно дополняет показатели состояния системы иммунитета в крови, характеризуя миграцию иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления, и лучше отражает функционирование местного иммунитета в отграниченном очаге воспаления. Предлагаемый способ эффективен, доступен и может найти широкое применение в клинической практике. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7