Способ восстановления гемопоэза у больного онкологическим заболеванием

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ГЕМОПОЭЗА У БОЛЬНОГО ОНКОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЕМ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии(72) Авторы Исайкина Янина Ивановна Алейникова Ольга Витальевна Минаковская Нина Вячеславовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии(57) 1. Способ восстановления гемопоэза у больного онкологическим заболеванием, включающий мобилизацию, коллекцию и трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток с последующей трансплантацией мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга пациента или донора, отличающийся тем, что трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток осуществляют при содержании в трансплантате фракции 34 клеток (0,64-1,3)106/кг массы пациента, при этом мезенхимальные стволовые клетки трансплантируют в количестве не менее 0,5106/кг массы пациента. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из 20-30 мл костного мозга, взятого посредством костномозговой пункции под локальной анестезией. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что используют мезенхимальные стволовые клетки, выделенные и экспансированныев, причем среда дополнительно содержит 10 эмбриональной телячьей сыворотки, -глутамин в концентрации 2 мМ и 2-меркаптоэтанол в концентрации 10-4 М. Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской биотехнологии и может быть использовано для ускорения восстановления гемопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) больным с онкологическими и гематологическими заболеваниями. Для лечения больного с далеко зашедшими стадиями или рецидивом злокачественных заболеваний используют высокодозную полихимиотерапию, а в некоторых случаях и лучевую терапию с последующей аутотрансплантацией гемопоэтических стволовых клеток(ГСК). Успех применения трансплантации ГСК зависит от достаточного количества 11932 1 2009.06.30 трансплантируемых ГСК, их приживления у облученного пациента, от быстрого восстановления у реципиента гемопоэза после ТГСК. Проведение курса интенсивной лучевой и химиотерапии приводит к повреждению гемопоэтических клеток костного мозга и всех естественных факторов антимикробной защиты организма, поэтому актуальным является сокращение срока приживления трансплантата и восстановления нормального гемопоэза у пациента после трансплантации, что существенно снижает риск развития тяжелых инфекций. Интенсивная лучевая и химиотерапия также приводят к повреждению клеток стромы костного мозга, что проявляется в снижении числа клоногенных фибробластов после аллогенной трансплантации ГСК на протяжении нескольких лет у детей и практически пожизненно у взрослых, а также в ухудшении функционального состояния стромы костного мозга у пациента после проведения трансплантации 1, 2. У большинства пациентов восстановление гемопоэза после аутологичной трансплантации периферических стволовых клеток (ПСК) происходит сравнительно быстро (абсолютное число нейтрофилов 500/мкл достигается на 11 день, тромбоцитов 20000/мкл на 12 день). Однако приблизительно у 5 пациентов после аутотрансплантации гемопоэтических стволовых клеток существует задержка восстановления нейтрофилов и тромбоцитов, и наиболее часто это связано с низкой дозой трансплантируемых 34 клеток/кг массы пациента 3, 4. Направление клеточной терапии по применению мезенхимальных стволовых клеток(МСК) для поддержки гемопоэза и сокращения периода посттрансплантационной нейтропении при ко-трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками связано с основными свойствами МСК 1) способностью формировать стромальное микроокружение кроветворного костного мозга 2) высокой пролиферативной активностью мезенхимальных стволовых клеток, которая после выделения их из тканей и экспансии в культуре дает возможность получить эффективный биотрансплантат МСК. Воздействие мезенхимальных стволовых клеток на предшественники гемопоэза осуществляют посредством секреции растворимых цитокинов, хемокинов, пептидов, медиаторов и гормонов, с одной стороны, и образованием внеклеточного матрикса из молекул коллагена, фибронектина, ламинина, обеспечивающих адгезию гемопоэтических клеток,с другой. Колониестимулирующий фактор (КСФ) интерлейкин-6 (-6), -1, -7, -8,фактор стволовых клеток (ФСК), -3-лиганд, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), тромбопоэтин, инсулиноподобный фактор роста,трансформирующий фактор роста (ТФР) непрерывно синтезируются клетками стромы,поддерживая физиологически нормальное количество клеток крови в организме. Причем-1 является основным индуктором продукции цитокинов, а ТФР обладает эффектом ингибирования гемопоэза 5. Общепринятой терапевтической пороговой дозой 34 клеток/кг веса пациента,предполагающей успешное приживление трансплантата и коррелирующей с быстрым восстановлением гемопоэза после трансплантации, является 2,5106 клеток/кг 6, 7. Недостаточное количество 34 клеток в аутотрансплантате после проведения коллекции гемопоэтических клеток встречается в случаях, когда пациент получил большое число блоков полихимиотерапии или высокодозного облучения до проведения коллекции,которые оказывают отрицательное воздействие на мобилизацию 34 клеток гранулоцитарным колониестимулирующим фактором Г-КСФ 8. Известным общепринятым способом для успешного восстановления гемопоэза после проведения трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при низком содержании 2 11932 1 2009.06.30 34 клеток в трансплантате после первой коллекции является способ проведения повторной попытки коллекции периферических стволовых клеток или эксфузии значительного объема костного мозга 9, 10. Недостатком способа является необходимость проведения пациенту или донору повторной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток с применением Г-КСФ в дозе 5 мкг/м 2 подкожно ежедневно в течение 5-7 суток. При этом повторная мобилизация не всегда эффективна. В этом случае выполняют травматичную процедуру эксфузии костного мозга в количестве не менее 1 литра, проводимую под общей анестезией. Известен способ применения биотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток,полученных из костного мозга доноров, в качестве ко-трансплантата при аллогенной трансплантации у детей с онкогематологическими заболеваниями, способствующий ускорению приживления аллогенного трансплантата при дозе 34 клеток в трансплантате донора в среднем 3,2106/кг. Для ко-трансплантации используютполученные донорские МСК 11. Недостатком является ограниченность применения способа минимальным содержанием в трансплантате после мобилизации и последующей коллекции числа 34 клеток(не менее 2106/кг веса реципиента). Наиболее близким, принятым за прототип, является способ применения биотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток для ускорения восстановления гемопоэза после проведения аутологичной трансплантации ГСК пациентам с раком молочной железы,у которых после мобилизации получено эффективное для приживления трансплантата содержание гемопоэтических стволовых клеток 12. Мобилизацию периферических стволовых клеток пациента проводят путем подкожной инъекции Г-КСФ ежедневно в дозе 10 мкг/кг. Мезенхимальные стволовые клетки выделяют из костного мозга пациентов и экспансируютв средес низким содержанием глюкозы с добавлением 10 эмбриональной бычьей сыворотки. МСК вводят пациентам внутривенно в дозе, эффективной для поддержки гемопоэза. Рекомендуемая эффективная доза МСК не менее 2105/кг веса пациента и не более 7105/кг. Инъекцию мезенхимальных стволовых клеток проводят одновременно с гемопоэтическими стволовыми клетками или до/после трансплантации гемопоэтических клеток. Доза трансплантированных ядросодержащих клеток была не менее 15108/кг веса пациента. Через 3 часа после проведения аутологичной трансплантации больные получают Г-КСФ в дозе 250 мкг/м 2 подкожно ежедневно до восстановления нейтрофилов в периферической крови до 1000/мл в течение 3 дней. Недостатками этого способа являются применение МСК для ускорения приживления трансплантата при высоком содержании в аутотрансплантате пациента гемопоэтических клеток (не менее 15108/кг веса пациента), что само по себе предполагает успешное восстановление гемопоэза эффективность способа не исследовалась для пациентов с числом 34 клеток в трансплантате ниже общепринятой пороговой дозы назначение пациентам в раннем посттрансплантационном периоде Г-КСФ в дозе 250 мкг/м 2 также способствует ускоренному приживлению трансплантата. По литературным данным, все известные исследования по применению ко-трансплантации мезенхимальных стволовых клеток с ГСК, проведенные в настоящее время среди различных групп пациентов, предполагают эффективную для приживления высокую дозу 34 клеток/кг веса пациента в трансплантате 13, 14. Задача, на решение которой направлен предлагаемый нами способ, заключается в улучшении состояния стромы костного мозга пациентов с онкологическими заболевания 3 11932 1 2009.06.30 ми и возможности использовать для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток трансплантат с низким содержанием С 34 клеток (0,7-1,3106/кг) у пациентов после первой мобилизации ПСК. Мы не предлагаем новый способ восстановления гемопоэза после ко-трансплантации гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток, а предлагаем его применение по новому назначению, а именно в тех случаях, когда при слабом ответе на мобилизацию Г-КСФ фактором или большом весе пациента после коллекции ГСК в аутологичном или аллогенном трансплантате наблюдают низкое содержание ядросодержащих клеток и фракции 34 клеток 0,7-1,3106/кг, ограничивающее использование этого коллекционного продукта для проведения трансплантации. Предложенный способ осуществляют следующим образом. 1. Мобилизацию ПСК у пациентов и доноров проводят с использованием Г-КСФ (препараты Нейпоген или Граноцид) по следующей схеме Г-КСФ 10 мкг/кг/сут. подкожно вводят в зависимости от массы тела пациента или донора в течение 5-10 дней, при ежедневным контроле количества лейкоцитов (Л) в периферической крови. Лейкоферез проводят при условии Л 30106/мл. Для афереза ПСК используют сепаратор клеток крови-3000(, США). 2. Процессинг полученного лейкоконцентрата включает плазмоэкстракцию и по необходимости седиментацию эритроцитов. Определяют основные характеристики трансплантата ПСК количество ядросодержащих и 34 клеток. 3. Количество 34 клеток в трансплантате ПСК определяют методом проточной цитофлуориметрии на приборе( , США) с применением моноклональных антител ( , США). 4. Полученный трансплантат ПСК замораживают с применением программного криозамораживателя 1810 (-, США) при конечной концентрации криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) 10 в аутологичной плазме и переносят для хранения в криохранилище с жидким азотом при-196 С до момента проведения трансплантации. 5. При количестве 34 клеток/кг веса пациента 1,3106/кг, то есть значительно ниже общепринятой пороговый дозы 2,5106/кг, повторную мобилизацию и коллекцию ПСК не проводят. 6. После получения письменного информированного согласия родителей или пациентов об участии в изучении эффекта биотрансплантата МСК на приживление трансплантата ГСК принимают решение о приготовлении и дальнейшем использовании биотрансплантата МСК. 7. Эксфузию костного мозга в объеме 20-30 мл производят у пациента или донора посредством костномозговой пункции под локальной анестезией за 30-50 суток до планируемой трансплантации ПСК. 8. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяют на Гистопаке плотностью 1077 (,США), дважды отмывают в растворе Хенкса, ресуспендируют вс 10 эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) (, США), 2 мМ/л-глутамином и 10-4 М/л 2-меркаптоэтанолом и переносят в концентрации 2-3106/мл во флакон объемом 175 см 2 (, Германия) в 30 мл среды для дальнейшей экспансии. 9. Клетки инкубируют при 37 С в 5 СО 2. Через 48 ч проводят смену среды, удаляя таким образом неадгезированные клетки, находящиеся в суспензии. При 80-90 покрытии поверхности флакона прикрепленными клетками их снимают при помощи обработки 4 мл 0,25 трипсин-ЕДТА (, США) в течение 5-7 мин, затем трипсин инактивируют добавлением 2 мл ЭТС и снятые МСК в количестве 1106/кг пересаживают в новые культуральные флаконы 175 см 2. 4 11932 1 2009.06.30 10. Путем пассирования получают биотрансплантат МСК в количестве не менее 0,5106/кг веса пациента. 11. После снятия мезенхимальных стволовых клеток последнего пассажа с поверхности всех культуральных флаконов клетки осаждают путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают, клетки отмывают и разводят в концентрации 5106/мл в физиологическом растворе для дальнейшего введения пациенту. 12. Перед инфузией пациенту полученные методом экспансии в культуре клетки идентифицируют на проточном цитофлуориметре( , США) на наличие поверхностных маркеров 105, 90. Биотрансплантат МСК содержит не менее 90 клеток с поверхностными маркерами 105 и 90. 13. Перед проведением аутологичной и аллогенной трансплантации ГСК пациентам проводят кондиционирование, при котором блок полихимиотерапии соответствует протоколу для каждой нозологии. 14. Суспензию культивированных мезенхимальных стволовых клеток в 10-20 мл физиологического раствора вводят пациенту внутривенно в течение 1 часа после проведения трансплантации ПСК. 15. Анализ показателей крови осуществляют ежедневно. 16. Приживление трансплантата характеризуется количеством нейтрофилов в анализе периферической крови пациента 500/мкл (0,5109 /л), число ретикулоцитов 0,1 в течение 3 дней. Предлагаемый способ отличается от известных тем, что позволяет восстановить гемопоэз при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с применением биотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток, при этом использовать для терапии трансплантат с содержанием 34 клеток значительно ниже общепринятой пороговой дозы (минимальная доза 0,8106/кг) избежать повторной мобилизации периферических стволовых клеток избежать выполнения эксфузии костного мозга большого объема при низком количестве ядросодержащих клеток и фракции 34 клеток в трансплантате после мобилизации и коллекции ПСК. Предлагаемый способ восстановления гемопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток основан на экспериментально доказанном факте эффективного действия биотрансплантата МСК для поддержки гемопоэза при ограниченной дозе 34 клеток/кг. Способ применен при проведении восьми пациентам детского возраста со злокачественными новообразованиями трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Семи пациентам проведена аутологичная трансплантация и одному пациенту - аллогенная трансплантация. Всем пациентам для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток назначен Г-КСФ Граноцид в дозе 10 мкг/кг в сутки подкожно. Аферез проведен при Л 30106/мл. Содержание 34 клеток/кг в трансплантате каждого пациента было недостаточным и составляло 1,14106/кг (0,64-1,3106/кг), что значительно ниже пороговой дозы 2,5106/кг. Доза инфузированных мезенхимальных стволовых клеток составляет 0,8106/кг (0,5-1,2106/кг). Эффективность предложенного способа подтверждена приживлением трансплантата у всех пациентов. Восстановление нейтрофилов 500/мкл наблюдают в среднем на 10 сутки, восстановление эритропоэза (ретикулоциты 0,1 ) - в среднем на 11 сутки. Конкретные клинические примеры. Пример 1. Пациент П. Возраст 16 лет.истории болезни 1028. Диагноз лимфогранулематозстадия, ранний рецидив. Костный мозг не вовлечен. В протокол лечения входит проведе 5 11932 1 2009.06.30 ние аутологичной трансплантации костного мозга. До момента проведения аутологичной трансплантации ПСК больной получил 6 блоков полихимиотерапии и 2 курса лучевой терапии (36 Гр и 75 Гр соответственно). Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток проведена через 13,5 месяцев от начала заболевания. На момент проведения аутотрансплантации наблюдают стабилизацию болезни. Г-КСФ Граноцид для мобилизации стволовых клеток назначен в дозе 10 мкг/кг в сутки подкожно. Мобилизация проведена в течение 5 дней. Лейкоферез начат при Л 31109/л. В результате коллекции трансплантат ПСК пациента содержит 4,6108/кг ядросодержащих клеток и 1,3106/кг 34 клеток. Клетки заморожены и хранятся в жидком азоте при-196 С до момента проведения трансплантации. За 30 суток до планового проведения аутологичной трансплантации у пациента взят костный мозг в объеме 30 мл. В результате выделения и экспансии получен биотрансплантат мезенхимальных стволовых клеток в дозе 0,6106/кг. Перед аутологичной трансплантацией пациенту проведено кондиционирование кармустин 300 мг/м 2 цитозар 800 мг/м 2 этопозид 400 мг/м 2 мелфалан 140 мг/м 2. Инфузия мезенхимальных стволовых клеток проведена в течение часа после трансплантации ПСК. Восстановление нейтрофилов 500/мкл наблюдается на 10 сутки,1000/мкл - на 11 сутки, ретикулоцитов 0,1- на 11 сутки, что свидетельствует о быстром приживлении трансплантата. Состояние пациента на 16 сутки оценивают как компенсированное, наблюдают стабилизацию основного заболевания, независимость от гемотрансфузий. Индекс Карновского 90 . В течение 3-х лет после проведения ко-трансплантации пациент жив. Пример 2. Пациент Л. Возраст 15 лет.истории болезни 3040. Диагноз Неходжкинская лимфома (В-тип)стадия, ранний рецидив. Костный мозг вовлечен. В протокол лечения входит проведение аутологичной трансплантации костного мозга. До момента проведения аутологичной трансплантации ПСК пациент получил 8 блоков полихимиотерапии. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток проведена через 12 месяцев от начала заболевания. На момент проведения аутотрансплантации наблюдают стабилизацию болезни. Г-КСФ Граноцид для мобилизации стволовых клеток назначен в дозе 10 мкг/кг в сутки подкожно. Мобилизация проведена в течение 8 дней. Лейкоферез начат при Л 33109/л. В результате коллекции трансплантат ПСК пациента содержит 8,1108/кг ядросодержащих клеток и 0,810 /кг 34 клеток. Клетки заморожены и хранятся в жидком азот при-196 С до момента проведения трансплантации. За 30 суток до планового проведения аутологичной трансплантации у пациента взят костный мозг в объеме 20 мл. В результате выделения и экспансии получен биотрансплантат мезенхимальных стволовых клеток в дозе 1,0106/кг. Перед аутологичной трансплантацией пациенту проведено кондиционирование бусульфан 480 мг/м 2 вепезид 900 мг/м 2 эндоксан 4500 мг/м 2. Инфузия мезенхимальных стволовых клеток проведена в течение часа после трансплантации ПСК. Восстановление нейтрофилов 500/мкл наблюдают на 11 сутки,1000/мкл - на 13 сутки,ретикулоцитов 0,1- на 12 сутки, что свидетельствует о быстром приживлении трансплантата. Состояние пациента компенсированное, нет признаков основного заболевания,из осложнений - геморрагический цистит, обусловленный высокими дозами эндоксана. В течение 2-х лет после проведения ко-трансплантации пациент жив. Таким образом, предлагаемый способ восстановления гемопоэза при трансплантации низкой дозы гемопоэтических стволовых клеток эффективен и может быть использован в онкогематологических клиниках Республики Беларусь. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7