Способ определения уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого

12 1/58 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРЕАЗЫ В ОСАДКЕ ТОЩАКОВОЙ ПОРЦИИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОДЕРЖИМОГО(71) Заявитель Государственное высшее учебное заведение Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Конорев Марат Русланович Литвяков Александр Михайлович Крылов Юрий Васильевич Матвеенко Майя Ефимовна Рящиков Анатолий Аркадьевич Ковалев Александр Владимирович(73) Патентообладатель Государственное высшее учебное заведение Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ определения уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого,заключающийся в том, что тощаковую порцию желудочного содержимого центрифугируют, значение рН полученного осадка доводят до 6,75, вновь центрифугируют, после чего к объему осадка добавляют 2 объема идентификационного теста, достигая конечной концентрации мочевины в растворе 33 г/л и фенол-рота 0,133 г/л, инкубируют при комнатной температуре 2-24 ч и при появлении малиновой окраски определяют наличие уреазы.(56)5439801 , 1995.2084533 1,1997.2069699 1, 1996.1564192 1, 1990.2092855 1, 1997.1659850 1, 1991.0643942 1, 1994. Изобретение относится к медицине, в частности к внутренним болезням и лабораторной диагностике, а также к биохимии, и может быть использовано для определения уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого для диагностикии контроля за эффективностью этиопатогенетического лечения хронического гастрита типа В 6 и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки 3, 4.продуцирует в большом количестве фермент уреазу 9. Продукция уреазы бактерией приводит к ее накоплению в ткани желудка 12. Это дает возможность использовать методы обнаружения уреазы непосредственно в биоптатах слизистой оболочки желудка. 5259 1 К настоящему времени предложено много различных тестов для обнаружения уреазы в слизистой оболочке желудка. В основе всех биохимических тестов лежит один и тот же принцип. При гидролизе мочевины под действием уреазы образующийся ион аммония приводит к сильному увеличению рН среды. Это фиксируется с помощью индикатора(фенол-рот), а также визуально, по изменению окрашивания среды (фенол-рот имеет желтый цвет при рН 6,8 и ярко малиновый при рН 8,4) 12. Высокочувствительными и специфичными являются методы, определяющие только тканевую, не бактериальную, уреазу. Это так называемые холодные методы, работающие при комнатной температуре, содержащие бактерицидные добавки, уничтожающие любую микрофлору в биоптате. Существующие биохимические тесты имеют один существенный недостаток - в качестве носителя тканевой уреазы используется биоптат слизистой желудка. Это делает данные методы инвазивными, увеличивает количество биоптатов (для гистологического исследования и уреазного теста), что и ограничивает их применение. Некоторые авторы 2, 5 предлагают использовать для определения уреазы желудочное содержимое. Но в связи с тем, что рН желудочного сока имеет низкие значения при-инфекции, что затрудняет срабатывание индикатора, уреазный тест отличается малой информативностью (уреаза в желудочном содержимом определяется визуально только у 4,1-83,0 лиц, имеющих -инфекцию). Поэтому данный метод не нашел практического применения. Для повышения информативности метода предложено не визуально, а спектрофотометрически измерять активность уреазы желудочного содержимого с применением уреазного теста по минимальному изменению окраски раствора 14. Однако данная методика требует высокочувствительного прибора для определения активности. При этом спектрофотометрическое определение активности уреазы имеет большую разбежку в измерениях(опыт 0,74-0,92 единиц оптической плотности (ЕОП), контроль 0,01-0,66 ЕОП). Кроме этого выявляется уреаза вообще, а не только тканевая уреаза (желудочный сок используется без центрифугирования). Все это снижает диагностические возможности метода и ограничивает его практическое использование. Задачей изобретения является разработка визуального неинвазивного способа определения уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого, основанного на доведении рН среды осадка до 6,75 буфером с последующим центрифугированием и проведением уреазного теста. Выявление тканевой уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого связано с непрерывно протекающим естественным процессом обновления слизистой оболочки и постоянной десквамацией отмирающих клеток покровного эпителия в просвет желудка вместе с находящимися на их поверхностии продуктами их жизнедеятельности. Доведение рН среды осадка до 6,75 повышает чувствительность метода и позволяет визуально определять уреазу по изменению окраски раствора, без использования других высокочувствительных методик и приборов. В качестве прототипа предлагаемого изобретения принят существующий способ определения уреазы в биоптате слизистой оболочке желудка, позволяющий выявлять тканевую уреазу визуально, с применением быстрого уреазного теста 11. Прототип, по сравнению с вышеизложенными методами, обладает рядом преимуществ 1. Достаточная информативность (чувствительность - 88-99 , специфичность - 100,0 ) 8, 10, 17. 2. Простота выполнения. 3. Визуальная оценка результата. Наряду с преимуществами, прототип обладает и существенным недостатком. Он связан с инвазивностью данного метода. При этом биоптат слизистой, после проведения уреазного теста, не может быть использован для гистологического исследования. Это требует увеличения количества биоптатов при эндоскопическом исследовании. 2 5259 1 Сущность предложения заключается в том, что тощаковую порцию желудочного содержимого центрифугируют, значение рН полученного осадка доводят до 6,75, вновь центрифугируют, после чего к объему осадка добавляют 2 объема идентификационного теста,достигая конечной концентрации мочевины в растворе 33 г/л и фенол-рота 0,133 г/л, инкубируют при комнатной температуре 2-24 ч и при появлении малиновой окраски определяют наличие уреазы. Примеры осуществления способа. А. Общие положения. Выявлениепроизводили морфологическим методом, используя гистологические срезы, параллельно окрашенные гематоксилином и эозином, по методам РомановскогоГимзы и Вартина-Старри 16. Степень обсемененностиопределяли по количеству микробов в поле зрения микроскопа при увеличении 900 15 отсутствие интенсивно окрашенных форм бактерий , только немногочисленные бактерии фокально , умеренное количество бактерий в нескольких областях , изобилие бактерий в большинстве областей . Для определения уреазы в биоптате использовался быстрый уреазный тест(--, Германия). Оценку уреазы проводили по изменению окраски раствора с желтого цвета на ярко-малиновый цвет после инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч (положительная реакция) и 24 ч (слабоположительная реакция). Уреазный тест считался негативным, если изменение окраски раствора произошло после 24 ч инкубации при комнатной температуре. Нами обследовано 34 человека с заболеваниями гастродуоденальной зоны. При гистологическом исследовании биоптатов обнаружены хронический неатрофический гастрит антрального отдела желудка (23 ), атрофический гастрит (77 ), эрозии в желудке(68 ), хроническая язва желудка (14 ) и двенадцатиперстной (73 ). Н. обнаружен морфологическим методом, с помощью быстрого уреазного теста и уреазного теста осадка желудочного содержимого соответственно у 79 , 82 и 79 больных язвенной болезнью и у 53 , 56 и 53 больных хроническим гастритом. Степень обсемененностибыла выше у больных с активным процессом в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны. Оценку эффективности нашего метода диагностики и прототипа проводили у одних и тех же больных по методу. 7. В качестве метода сравнения использовали морфологический способ выявленияв биопсийном материале 16 с использованием гистологических срезов, параллельно окрашенных гематоксилином и эозином, по методам Романовского-Гимзы и Вартина-Старри. Б. Условия осуществления способа. Идеальная концентрация субстрата в ферментативных реакциях должна превышать в 50-100 раз Км фермента (показатель сродства фермента к субстрату). Это связано с тем,что если субстрат находится в избытке, то скорость реакции зависит только от активности самого фермента. Уреаза Нр имеет Км 0,32 г/л (8 мМ) 13. Следовательно, идеальная концентрация мочевины в тесте должна быть в пределах 16-32 г/л. Выше этого значения активность фермента может подавляться 1. В предлагаемом нами идентификационном тесте для определения уреазы в осадке желудочного сока исходная концентрация мочевины составляет 50 г/л. При добавлении к 1 объему осадка 2 объемов идентификационного теста конечная концентрация мочевины составляет 33 г/л, что практически соответствует вышеуказанным требованиям. Способ осуществляют следующим образом. Порцию желудочного сока, полученную натощак, центрифугируют при 1,5-2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадок удаляют пастеровской пипеткой. Осадок отмывают 10-кратным объемом 0,01 М фосфатного буфера рН 6,75, центрифугируют при 1,5-2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадок удаляют пастеровской пипеткой. К 1 объему осадка добавляют 2 объема идентификационного теста и инкубируют при комнатной температу 3 5259 1 ре в течение 2-24 ч. В качестве контроля используют 1 объем 0,01 М фосфатного буфера рН 6,75 и 2 объема идентификационного теста. Состав идентификационного теста для определения уреазной активности в осадке желудочного сока мочевина - 5,0 г, фенол-рот (0,2 ) - 10 мл, азид натрия - 20 мг. Довести до 100 мл 0,4 М фосфатным буфером, рН 6,75. Модификация способа отличается тем, что идентификационный тест не содержит буферного раствора, а осадок отмывают 10-кратным объемом 0,04-0,4 М фосфатного буфера рН 6,75. При рН среды желудочного содержимого 6,75 и выше 10-кратный объем буфера не используют, а сразу к осадку добавляют идентификационный тест. Эффективность метода. Оценка эффективности предложенного метода и прототипа представлена в таблице. Оценка эффективности способа определения уреазы в осадке тощаковой порции желудочного содержимого через 2 ч и 24 ч инкубации. Точность Диагностическая эффективность Специфичность Чувствительность Предсказующая ценность пробы при отрицательном результате 6 Предсказующая ценность пробы при положительном результате Эффективность способа заключается в том, что он позволяет повысить диагностическую эффективность, чувствительность и предсказующую ценность метода определения уреазы при отрицательном результате и дает возможность визуально определять уреазу в осадке тощаковой порции желудочного содержимого без использования биоптата слизистой, специального оборудования и приборов. Тощаковую порцию можно получать с применением как эндоскопического метода, так и зондового, с полным извлечением желудочного содержимого натощак. Клинические примеры. Больной Г., 1978 г рождения, находился в гастроэнтерологическом отделении Витебской областной клинической больницы с 10.06.98 по 12.06.98 с диагнозом хронический гиперпластический зернистый гастрит, с повышенной секреторной функцией желудка,обострение, средней тяжести. Хронический фолликулярный дуоденит. Поступил с жалобами на голодные, ночные боли в эпигастрии, купирующиеся после приема пищи, тошноту, горечь во рту, урчание в животе. Болевой синдром беспокоит в течение двух недель. В анамнезе страдает хроническим гастродуоденитом около 2 лет. Отмечает нерегулярное питание, обильную еду на ночь. При пальпации определяется болезненность в эпигастрии, пилородуоденальной области. При проведении ФЭГДС 2.06.98. обнаружены гиперпластический зернистый гастрит, фолликулярный бульбит. При морфологическом исследовании желудка и двенадцатиперстной кишки обнаружен хронический атрофический гастрит антрального отдела желудка с гиперплазией поверхностного и шеечного эпителия с умеренным воспалением , активностью , выраженной обсемененностью. Хронический неатрофический дуоденит с умеренным воспалением , активностью , отсутствием(-). Быстрый уреазный тест с использованием биоптата слизистой антрального отдела желудка оказался положительным. Уреазный тест 4 5259 1 осадка желудочного содержимого с использованием модифицированного идентификационного теста оказался тоже положительным. Больной С., 1957 г рождения, находился на диспансерном наблюдении в клинике научно-исследовательского клинического института радиационной медицины и эндокринологии (г. Витебск) с диагнозом хронический очаговый атрофический гастрит, с сохраненной секреторной функцией желудка, обострение, средней тяжести. Хронический атрофический дуоденит. Эрозия луковицы двенадцатипестной кишки. Обратился 26.05.98 с жалобами на боли, чувство тяжести и распирания в эпигастрии после еды, отрыжку пищей. При пальпации определяется умеренная болезненность в гастродуоденальной зоне. При проведении ФЭГДС 26.05.98 обнаружены хронический очаговый атрофический гастрит антрального отдела желудка, умеренной активности, одна поверхностная эрозия передней стенки луковицы двенадцатиперстной кишки. При морфологическом исследовании желудка и двенадцатиперстной кишки диагностирован хронический антральный гастрит с минимальным воспалением , неактивный (-), с отсутствием(-). Хронический атрофический дуоденит с поверхностными эрозиями, с умеренным воспалением , неактивный (-), с отсутствием(-). Быстрый уреазный тест с использованием биоптата слизистой антрального отдела желудка показал отрицательный результат. Уреазный тест осадка желудочного содержимого с использованием модифицированного идентификационного теста оказался тоже отрицательным. Источники информации 1. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А., Яковенко Э.П. Хронический гастрит. Амстердам, 1993. - С. 306-308. 2. Баженов Л.Г., Ходжаева Н.У., Садыков Р.А., Саидханов Б.А. Выделениеиз желудочного сока // Клин. лаб. диагностика. - 1993. -5. - С. 19-22. 3. Голиков С.Н., Рысс Е.С., Фишзон-Рысс Ю.И. Рациональная фармакотерапия гастроэнтерологических заболеваний. - СПб. Гиппократ, 1993. - С. 288. 4. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. - М. Медицина, 1986. - С. 224. 5. Дорофейчук В.Г., Потехин П.П., Закомерный А.Г. Неинвазивный способ диагностики пилорического хеликобактериоза // Клин. лаб. диагностика. - 1997. -8. - С. 42-44. 6. Мараховский Ю.Х. Общая гастроэнтерология. Основная терминология и диагностические критерии. - Мн., 1995. 7.,,,.// . . . - 1981. - . 94, 42. - . 553-600. 8..,.,..// . . - 1996. - . 44. - . 523-526. 9.,,. -// . - 1984. - .1. - . 1348. 10.., - .,..// . . . . - 1996. - . 8. - . 53-56. 11.,,.-// . . . - 1987. - . 82. - . 200-201 (прототип). 12.,.-// . - 1985. - . 1. - . 1443-1444. 13..,.,.,.//. - 1988. - . 26. - . 831-836. 5 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.