Способ прогнозирования быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ БЫСТРО ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ ЮВЕНИЛЬНОГО РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА(71) Заявитель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(73) Патентообладатель Белорусский государственный институт усовершенствования врачей(57) Способ прогнозирования быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита путем комплексного исследования синовиальной жидкости и крови, отличающийся тем, что определяют активность лизосомных ферментов кислой дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы), кислой фосфатазы (КФ), маннозидазы (-МАН) в синовиальной жидкости и гиалуронидазы (ГИА) в сыворотке крови уровень сиаловых кислот (СИК СЖ), величину цитоза (ЦИТ), относительного содержания рагоцитов (РАГ), полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в синовиальной жидкости уровень сиаловых кислот (СИК СК) в сыворотке крови, количество лейкоцитов периферической крови (ЛПК), скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и при значении показателя ДНК-азы более 3,510-3 мкмоль на 1 г белка, КФ более 8,0 мкмоль на 1 г белка, более 2,6 мкмоль на 1 г белка, ГИА более 18 мкмоль на 1 г белка, СИК СЖ более 100 УЕ, ЦИТ более 20109/л, РАГ более 15 , ПЯЛ более 75 отношения СИКСК 2,53,49 прогнозируют угрозу развития быстро прогрессирующего течения СИКСЖ(56) 1. Диагностика и лечение хронических артритов у детей и подростков Методические рекомендации. Харьков, 1991. - С. 4, 5, 8, 9. Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии. Известен способ диагностики и прогнозирования течения ювенильного ревматоидного артрита, основанный на результатах изучения в сыворотке крови в диагностических титрах ревматоидного фактора (РФ) с помощью реакции Ваалер-Роузе и латекс-теста, выявления в повышенных титрах циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), комплемента, иммуноглобулинов классов А, М, , изменения содержания и функционального состояния Т- и В-лимфоцитов, определения уровня серомукоида, сиаловых кислот, диспротеинемии с 3633 1 гипергаммаглобулинемией, а также величины скорости оседания эритроцитов (СОЭ), числа лейкоцитов и относительного содержания нейтрофилов в периферической крови 1. Однако данный способ обладает следующими недостатками. 1) Авторами представлен комплекс иммуно-биохимических критериев диагностики и течения ювенильного ревматоидного артрита, большинство из которых по определению самих же авторов не являются специфическими лабораторными показателями для постановки диагноза и прогноза ювенильного ревматоидного артрита 1. 2) Диагностическая ценность серологических реакций на ревматоидный фактор в детском возрасте значительно ниже, чем у взрослых. Это связано с редким его обнаружением в сыворотке крови при ревматоидном артрите у детей (приблизительно у 25-30 больных) и с его присутствием при многих других системных заболеваниях соединительной ткани. 3) Выявление в сыворотке крови у больных в повышенных титрах циркулирующих иммунных комплексов, комплемента, изменения содержания иммуноглобулинов классов А, М, , содержания и функционального состояния Т- и В-лимфоцитов наблюдается при целом ряде аутоиммунных заболеваний, что снижает диагностическую значимость указанных показателей при ревматоидном артрите у детей. 4) Предлагаемые автором рутинные лабораторные тесты (серомукоид, сиаловые кислоты, скорость оседания эритроцитов, относительное содержание нейтрофилов в периферической крови) обладают низкой диагностической информативностью, специфичностью и чувствительностью. 5) Существенным недостатком данного способа является отсутствие у авторов рекомендаций по исследованию специфических патогенетических маркеров ревматоидного артрита - лизосомных ферментов, а также по сопоставлению величин содержания указанных метаболитов в синовиальной жидкости и крови. Общим признаком для указанного и заявленного способа является использование для исследований крови. Синовиальную жидкость получали при пункции коленных суставов, центрифугировали на лабораторной центрифуге в режиме 1500 об/мин в течение 10 мин. Для дальнейших биохимических исследований использовали супернатант. Забор крови у обследуемых лиц проводился утром натощак из локтевой вены в день пункции сустава. Изучение активности в синовиальной жидкости кислой дезоксирибонуклеазы, кислой фосфатазы, -маннозидазы, а в сыворотке крови - гиалуронидазы проводили по методикам, описанным ранее. Уровень сиаловых кислот изучали по Гессу. Анализ синовиоцитограммы осуществляли по В. Н. Павловой с соавт. Авторами в научно-медицинской и патентной литературе прямого прототипа заявляемого способа не обнаружено. Задачей изобретения является прогнозирование быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита на основе интегрального использования высоко информативных энзимологических и цитобиохимических маркеров. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ прогнозирования быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита путем интегрального изучения комплекса показателей синовиальной жидкости и крови, а именно определения активности кислой дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы), кислой фосфатазы (КФ), -маннозидазы (-МАН) в синовиальной жидкости и гиалуронидазы (ГИА) в сыворотке крови уровня сиаловых кислот (СИК СЖ), величины цитоза (ЦИТ), относительного содержания рагоцитов (РАГ), полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в синовиальной жидкости уровня сиаловых кислот (СИК СК) в сыворотке крови, количества лейкоцитов периферической крови (ЛПК), скорости оседания эритроцитов (СОЭ), а также величин отношений следующих признаков ЦИТ СИК СЖ СИК СК СИК СЖ ЛПК СОЭ и при получении значений активности в синовиальной жидкости кислой дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) более 3,510-3 мкмоль на 1 г белка кислой фосфатазы (КФ) более 8,0 мкмоль на 1 г белка -маннозидазы (МАН) более 2,6 мкмоль на 1 г белка гиалуронидазы сыворотки крови (ГИА) более 18 мкмоль на 1 г белка уровня сиаловых кислот в синовиальной жидкости (СИК СЖ) более 100 УЕ, цитоза (ЦИТ) более 20109/л,рагоцитов (РАГ) более 15 , полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) более 75 и величин отношений вышеуказанных признаков, соответственно равных - 1,5-2,25 2-3,99 2,5-3,49 включительно, диагностируют угрозу развития быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита. Значимая роль в патофизиологии ревматоидного воспаления, механизмах повреждения соединительной ткани отводится лизосомным ферментам, которые имеют исключительное значение в хронизации воспалительного процесса. Лизосомные ферменты обладают различной субстратной специфичностью и способны разрушать все основные компоненты живой материи - белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и т. д. Эндонуклеаза - кислая дезоксирибонуклеаза принимает участие в патогенетическом механизме разрушения ядер клеток, ведущем к появлению новых антигенов и тем самым способствующему поддержанию циклического характера патологического процесса при ювенильном ревматоидном артрите и его хронизации. Ос 2 3633 1 новное свойство гиалуронидазы - быстро увеличивать проницаемость тканей для различных агентов - связано с активным воздействием ее на гиалуроновую кислоту - важный компонент основного вещества соединительной ткани, что создает условия для повышения эндотелиально-тканевой проницаемости. Характерная для ревматоидного артрита дезорганизация соединительной ткани, костно-хрящевая деструкция способствует высвобождению фосфатаз и накоплению их преимущественно в синовиальной жидкости. Точкой приложения -маннозидазы являются концевые остатки -маннозы в олиго-сахаридах, гликопептидах и гликопротеидах. Из обширной группы гликопротеидов в качестве маркера активности воспалительного процесса наиболее целесообразно и удобно использовать сиаловые кислоты. Исследования сино-виоцитограммы, как показателя состояния синовиальной среды сустава, расширяет объем информации о процессах, происходящих в нем. Отсюда вытекает необходимость более глубокого и интегрального изучения системы лизосомных ферментов, сиаловых кислот, клеточного состава синовиальной жидкости - наиболее доступного компонента синовиальной среды сустава у детей, их взаимосвязи с стандартными лабораторными тестами. По сравнению со способом диагностики и прогнозирования течения ювенильного ревматоидного артрита у детей по результатам изучения в сыворотке крови ревматоидного фактора, выявления в повышенных титрах циркулирующих иммунных комплексов, комплемента, иммуноглобулинов классов А, М, , изменения содержания и функционального состояния Т-и В-лимфоцитов, определения уровня серомукоида, сиаловых кислот, диспротеинемии с гипергаммаглобулинемией, а также величины скорости оседания эритроцитов,числа лейкоцитов и относительного содержания нейтрофилов в периферической крови, заявленный способ отличается тем, что основан на более детальной оценке комплекса лизосомных ферментов в синовиальной жидкости и сыворотке крови и клеточно-биохимического состава синовиальной жидкости, благодаря чему имеет большую диагностическую информативность, поскольку лизосомные ферменты принимают самое непосредственное участие в патофизиологических реакциях при ревматоидном воспалении. При этом используется комплексное изучение внутренней среды сустава (шокового органа при ревматоидном артрите) синовиальной жидкости, в частности, применяются величины активности комплекса лизосомных ферментов, уровня сиаловых кислот, показатель цитоза, относительное количество полиморфно-ядерных лейкоцитов, рагоцитов и отношений величин признаков, характеризующих как местный, так и общий воспалительный процесс при ювенильном ревматоидном артрите, которые в результате клинико-математических методов (последовательного статистического анализа) могут считаться маркерами быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита, так как они обладают высокозначимым фенотипическим различием, отвечают условиям интегрированности, что позволяет объективно установить границу по величине их между альтернативными группами больных, а именно у пациентов с медленно и быстро прогрессирующим течением ювенильного ревматоидного артрита. Клинические примеры, иллюстрирующие обоснованность и целесообразность использования предложенного способа прогнозирования развития быстро прогрессирующего течения ревматоидного артрита у детей. Пример 1. Больная Сизова А. В., рождения 3.07.1983 г., находилась в кардиоревматологическом отделении 4-й детской клинической больницы г. Минска с 6.02.1995 г. по 10.03.1995 г. (история болезни 688). Клинический диагноз Ювенильный ревматоидный артрит, преимущественно суставная форма, без поражения глаз, полиартрит, серонегативный вариант, быстро прогрессирующее течение, функциональная недостаточность суставов 1 ст. Поступила в стационар в связи с выраженным синовиитом коленных суставов, болями в голеностопных суставах и суставах обеих кистей. Болеет ювенильным ревматоидным артритом с апреля 1993. Неоднократно находилась на лечении и обследовании в кардиоревматологическом отделении. Исследование активности лизосомных ферментов и клеточно-биохимического состава синовиальной жидкости проведено у больной 1.03.1995 г. Ход определения 1. Для определения активности кислой дезоксирибонуклеазы 0,5 мл синовиальной жидкости смешивают с 1,5 мл забуферного раствора субстрата (состав субстрата дезоксирибонуклеиновую кислоту (1 мг/мл) растворяют в 0,5 М буфера ацетат натрия - уксусная кислота, рН 5,0, содержащем 0,20 М хлорида калия). Смесь инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Реакцию останавливают добавлением 2,0 мл 10 -ного водного раствора хлорной кислоты, затем смесь выдерживают при 4 С 20 мин и после этого центрифугируют. В надосадочной фракции интенсивность окраски определяют на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 260 мкм. Результаты сравнивают с контрольным опытом. 2. Для определения активности кислой фосфатазы смешивают 0,1 мл синовиальной жидкости и 0,4 мл 5 мМ раствора динатриевой соли 4-нитрофенилфосфата в буферном растворе ацетат натрия - уксусная кислота, рН 4,3 (1,2 мл). Смесь инкубируют при 37 С в течение 15 мин. Гидролиз останавливают на холоду с добавлением через 15 мин 0,2 мл 5 раствора сульфата цинка и 0,2 раствора гидроокиси натрия. После центрифугирования пробы к 0,3 мл супернатанта добавляют 2,2 мл глицинового буферного раствора, рН 10,5 (состав буфера 375 мг глицина и 10 мг 262 смешивают с 42 мл 0,1 раствора гидроокиси натрия и доводят объем дистиллированной водой до 100 мл). Ин 3 3633 1 тенсивность окраски определяют с помощью спектрофотометра СФ-16 при длине волны 400 мкм. Полученные результаты сравнивают с соответствующими данными контрольных проб. 3. Для определения активности -маннозидазы инкубационная смесь содержит 0,5 мл синовиальной жидкости, 0,5 мл 0,04 раствора р-нитрофенилманнопиронозида и 0,5 мл фосфатцитратного буфера, рН 4,6. Смесь инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Реакцию останавливают добавлением 1,5 мл буфера бикарбонат-карбоната, рН 9,5-10. Экстинкцию аниона нитрофенола измеряют спектрофотометром СФ-16 при длине волны 420 мкм. 4. Для определения активности гиалуронидазы 0,3 мл сыворотки крови смешивают с 0,2 мл забуферного раствора субстрата (состав субстрата 0,45 мл 98-100 раствора муравьиной кислоты, 0,78 г формиата натрия и 2,19 г хлорида натрия и доводят объем дистиллированной водой до 100 мл в полученном буферном растворе растворяют гиалуроновую кислоту (2,5 мг/мл. Смесь инкубируют 24 ч при 37 С и реакцию останавливают добавлением 0,1 мл боратного буфера (состав буфера 0,8 М раствора тетрабората калия, рН доводят до 8,9 концентрированной соляной кислотой). Пробирку ровно 3 мин нагревают на кипящей водяной бане и охлаждают под водопроводной водой, содержимое пробирки смешивают с 3,0 мл ДМАБ-реактива(состав реактива 10 г 4-диметиламинобензальдегида, 12,5 мл концентрированной соляной и 87,5 мл ледяной уксусной кислоты указанную смесь разводят в 10 раз ледяной уксусной кислотой) и выдерживают 12 мин при 37 С до развития окраски. Затем смесь еще раз охлаждают в холодной воде. Интенсивность окраски определяют спектрофотометрически при длине волны 575 мкм. Активность вышеуказанных лизосомных ферментов выражают в микромолях отщепленного остатка субстрата на 1 грамм белка за 1 ч инкубации для кислой дезоксирибонуклеазы и -маннозидазы, за 24 ч - для гиалуронидазы и за 15 мин - для кислой фосфатазы. Общий белок определяют колориметрически, общепринятым методом Лоури, используя реактив Фолина. 5. Для определения уровня сиаловых кислот в центрифужную пробирку наливают 1,0 мл синовиальной жидкости (или сыворотки крови) добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты (10 г на 100 мл) пробирку ставят на 5 мин в кипящую водяную баню, затем охлаждают в ледяной бане в течение 5 мин, смесь центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. К 0,4 мл надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусносернокислой смеси (состав смеси к 95 частям ледяной уксусной кислоты добавляют 5 частей концентрированной серной кислоты) и пробу повторно прогревают в кипящей водяной бане в течение 30 мин, при этом появляется красно-фиолетовая окраска раствора, затем охлаждают 5 мин на ледяной бане. Пробу колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контрольной пробы используют раствор серной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Результат выражают в условных единицах,для чего полученную величину экстинкции умножают на 1000. 6. Для подсчета количества лейкоцитов (цитоза) в синовиальной жидкости используют камеру Горяева. При этом нативную синовиальную жидкость разбавляют в 20 раз к 0,8 мл физиологического раствора добавляют 0,04 мл исследуемой жидкости и тщательно перемешивают. Пересчет количества подсчитанных клеток осуществляют на 1 л жидкости. 7. Подсчет относительного количества полиморфно-ядерных лейкоцитов и рагоцитов осуществляют в нативных мазках синовиальной жидкости (не позднее 15-20 мин после ее извлечения из полости сустава). Микроскопирование проводят под бинокулярным микроскопом с масляной эмульсией. 8. Количество лейкоцитов периферической крови и скорость оседания эритроцитов определяют с использованием стандартных лабораторных методов. Результаты исследования больной Сизовой А.В. кислая дезоксирибонуклеаза синовиальной жидкости - 4,5 мкмоль на 1 г белка кислая фосфатаза синовиальной жидкости - 12,1 мкмоль на 1 г белка-маннозидаза синовиальной жидкости - 6,4 мкмоль на 1 г белка гиалуронидаза сыворотки крови - 25,8 мкмоль на 1 г белка сиаловые кислоты синовиальной жидкости - 140 УЕ цитоз - 22,9109/л рагоциты 25 полиморфно-ядерные лейкоциты - 85 цитоз синовиальной жидкости 1,8 количество лейкоцитов периферической крови уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости 3,1 скорость оседания эритроцитов уровень сиаловых кислот сыворотки крови 2,8 . уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости 3633 1 Заключение величины изучаемых показателей в соответствии с заявленным способом находятся в пределах параметров, характерных для детей с быстро прогрессирующим течением ювенильного ревматоидного артрита. Пример 2. Больная Кизина М.О., рождения 7.01.1989 г., находилась в кардиоревматологическом отделении 4-й детской клинической больницы г. Минска с 24.10.1994 г. по 23.11.1994 г. (история болезни 4714). Клинический диагноз Ювенильный ревматоидный артрит, преимущественно суставная форма, с поражением глаз (ревматоидный увеит обоих глаз), полиартрит, серонегативный вариант, быстро прогрессирующее течение, рентгенологическая стадия 2,функциональная недостаточность суставов 2 ст. Поступила в стационар в связи с выраженным суставным синдромом в виде экссудативно-пролиферативных изменений коленных, голеностопных, локтевых, лучезапястных и мелких суставов кистей и стоп. При рентгенологическом исследовании выявлены эрозивные изменения со стороны костей, формирующих тазобедренный сустав выражены явления остеопороза. Болеет ювенильным ревматоидным артритом с 1991 г., неоднократно находилась на стационарном лечении. Исследование активности лизосомных ферментов и клеточно-биохимического состава синовиальной жидкости проведено у больной 26.10.1994 г. (синовиальная жидкость имела резко сниженную вязкость, была мутной с сукровичным оттенком) кислая дезоксирибонуклеаза синовиальной жидкости - 13,8 мкмоль на 1 г белка кислая фосфатаза синовиальной жидкости - 70,0 мкмоль на 1 г белка р-маннозидаза синовиальной жидкости - 14,8 мкмоль на 1 г белка гиалуронидаза сыворотки крови - 19,7 мкмоль на 1 г белка сиаловые кислоты синовиальной жидкости - 120 УЕ цитоз - 32,4109/л рагоциты - 21 полиморфно-ядерные лейкоциты - 89 цитоз синовиальной жидкости 1,9 количество лейкоцитов периферической крови уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости 3,2 скорость оседания эритроцитов уровень сиаловых кислот сыворотки крови 3,2 уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости Заключение у обследованной больной величина активности заявляемых лизосомных ферментов и предложенных отношений соответствующих признаков характерна для детей с быстро прогрессирующим течением ювенильного ревматоидного артрита. Пример 3. Больная Весенина О.Е., рождения 29.06.1981 г., находилась в кардиоревматологическом отделении 4-й детской клинической больницы г. Минска с 8.11.1994 г. по 9.11.1994 г. (история болезни 5024). Клинический диагноз Ювенильный ревматоидный артрит, преимущественно суставная форма, без поражения глаз, моноартрит правого коленного сустава, серонегативный вариант, медленно прогрессирующее течение, рентгенологическая стадия 1,функциональная недостаточность суставов 0 ст. Поступила в стационар в связи с синовиитом правого коленного сустава и болями в нем при ходьбе. Болеет ювенильным ревматоидным артритом с трехлетнего возраста. Исследование активности лизосомных ферментов и клеточно-биохимического состава синовиальной жидкости проведено у больной 8.11.94 г. кислая дезоксирибонуклеаза синовиальной жидкости - 1,4 мкмоль на 1 г белка кислая фосфатаза синовиальной жидкости - 2,2 мкмоль на 1 г белка-маннозидаза синовиальной жидкости - 0,52 мкмоль на 1 г белка гиалуронидаза сыворотки крови - 4,1 мкмоль на 1 г белка сиаловые кислоты синовиальной жидкости - 55 УЕ цитоз - 8,2109/л рагоциты - 0 полиморфно-ядерные лейкоциты - 60 цитоз синовиальной жидкости 1,1 количество лейкоцитов периферической крови уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости 9,2 скорость оседания эритроцитов уровень сиаловых кислот сыворотки крови 1,8 . уровень сиаловых кислот синовиальной жидкости 5 3633 1 Заключение у обследуемого ребенка содержание маркерных по быстро прогрессирующему течению ювенильного ревматоидного артрита признаков -величин активности лизосомных ферментов, цитоза, сиаловых кислот в синовиальной жидкости, а также отношений величин признаков в соответствии с заявляемым способом находятся в пределах параметров, не соответствующих указанному варианту течения ювенильного ревматоидного артрита. У данной больной ювенильный ревматоидный артрит характеризовался медленно прогрессирующим течением, что верифицировано длительным катамнестическим наблюдением. Таким образом, по сравнению с вышеуказанным предлагаемый способ обладает следующими преимуществами. 1. Позволяет уже на ранних стадиях ювенильного ревматоидного артрита прогнозировать развитие быстро прогрессирующего течения заболевания, что дает возможность практическим врачам своевременно назначить адекватное лечение и осуществить эффективную вторичную профилактику ювенильного ревматоидного артрита. 2. Использование изучения активности лизосомных ферментов в синовиальной жидкости и сыворотке крови, сиаловых кислот, клеточного состава синовиальной жидкости является методологически более доступным и дешевым способом в сравнении с цитохимическими и иммунологическими методами. 3. Способ основан на использовании системы признаков лизосомных ферментов, клеточного состава синовиальной жидкости, уровня сиаловых кислот, отношений - цитоза к количеству лейкоцитов периферической крови,уровня сиаловых кислот сыворотки крови к уровню сиаловых кислот синовиальной жидкости, уровня сиаловых кислот синовиальной жидкости к скорости оседания эритроцитов, которые в результате интегрального клиникоматематического анализа могут считаться маркерами быстро прогрессирующего течения ювенильного ревматоидного артрита, ранее не известными. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.