Способ определения N-ацетил-L-карнитина

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кравченко Елена Валериевна Петров Петр Тимофеевич Дубовик Борис Валентинович Романовский Дмитрий Иосифович Курман Петр Владимирович Шабуня Полина Станиславовна Фатыхова Светлана Анатольевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ определения -ацетилкарнитина в фармацевтических субстанциях, готовых лекарственных формах, биологически активных добавках к пище или полупродуктах фармацевтического производства, при котором пробу исследуемого образца растворяют в воде, фильтруют через мембранный фильтр и полученный раствор анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе, оснащенном колонкой с сорбентом 18 и спектрофотометрическим детектором, при температуре 25-30 С и длине волны 21020 нм с использованием в качестве подвижной фазы смеси 1-5 мМ раствора додецилсульфата натрия в воде или аналогичного анионного ПАВ с 2,51 и ацетонитрила при следующем изменении состава подвижной фазы линейный градиент от 25 до 40 ацетонитрила в течение 5 мин и изократический режим при 40 ацетонитрила в течение следующих 10 мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение ацетилкарнитина в фармацевтических субстанциях с использованием стандартного образца. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение ацетилкарнитина в одно- или многокомпонентных готовых лекарственных формах для энтерального и парентерального применения с использованием стандартного образца. 17743 1 2013.12.30 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение ацетилкарнитина в одно- или многокомпонентных биологически активных добавках к пище с использованием стандартного образца. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят количественное определение ацетилкарнитина в полупродуктах фармацевтического производства с использованием стандартного образца. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят качественное определение ацетилкарнитина в фармацевтических субстанциях, готовых лекарственных формах или биологически активных добавках к пище. Изобретение относится к области фармацевтической химии, фармацевтической и пищевой промышленности. Предложен способ количественного определения -ацетил-карнитина в фармацевтических субстанциях, в готовых лекарственных формах и биологически активных добавках к пище, включающих -ацетилкарнитин, а также в полупродуктах, получаемых на различных стадиях фармацевтического производства. Заявляемый метод может применяться и для качественного анализа субстанций и фармпродуктов, содержащих указанное вещество.-ацетилкарнитин широко используется в производстве готовых лекарственных средств (например, Карницетин фирмы ООО ПИК-ФАРМА, Москва, Россия) 1 и биологически активных добавок к пище (например,- фирмы ) 2. Для производства качественных, эффективных и безопасных для потребителя фармпродуктов необходимо проведение качественного анализа и оценка количественного содержания вышеназванного активного соединения в субстанции (для исключения приобретения и использования некачественного сырья), в полупродуктах (для промежуточного контроля качества продукции) и в финишных фармпродуктах. В настоящее время для количественного анализа -ацетилкарнитина широко используются ВЭЖХ методы с применением флуоресцентного детектора 3, 4. Эти методы заключаются в предварительной дериватизации -ацетилкарнитина с помощью различных веществ, например 1-аминоантрацена и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида , с последующим разделением полученных продуктов на обратно-фазовой колонке и регистрацией с помощью флуоресцентного детектора. Однако необходимо отметить, что применение этого метода удлиняет время анализа за счет трудоемкой пробоподготовки с использованием ряда дорогостоящих реактивов (например, и 9-(диазометил)антрацен (. Существуют методы анализа -ацетилкарнитина и других ацил-карнитинов методом ВЭЖХ с различными видами масс-детекторов 5, 6. Хотя эти методы отличаются высокой чувствительностью и точностью, но для них также характерна сложная пробоподготовка, требуется использование дорогостоящего масс-спектрометрического оборудования и наличие квалифицированных специалистов с опытом работы на подобном оборудовании, что зачастую недоступно для лабораторий фармацевтических предприятий. Также описаны методы определения концентрации -ацетилкарнитина с помощью ферментного анализа 7 и радиоферментного анализа 8, требующие, в свою очередь,работы с термолабильными ферментами и радиоактивными метками, работа с которыми требует соблюдения ряда правил техники безопасности, таких как отдельное помещение,специально обученный персонал, утилизация радиоактивных отходов. Описан метод анализа чистоты -карнитинатартрата методом ВЭЖХ - прототип заявляемого метода 9. Для анализа карнитина в данном методе используется высокоэффективная жидкостная обратнофазовая хроматография со спектрофотометрическим детектором и присутствием в подвижной фазе 10-6 додецилсульфата натрия. При этом в качестве внешнего стандарта используется смесь -карнитина гидрохлорида и -ацетил 2-карнитина 9. Данный метод используется для определения количественного содержания-карнитина в -карнитинтартрате его применение с целью качественного и количественного анализа -ацетилкарнитина, в т.ч. в фармацевтической и пищевой промышленности, предложено не было 9. Задачей настоящего изобретения является направленная разработка способа качественного и количественного определения -ацетилкарнитина в фармацевтических субстанциях, в готовых лекарственных формах и биологически активных добавках к пище с или без вспомогательных веществ, а также в полупродуктах, получаемых на различных стадиях фармацевтического производства. При этом предпочтительно использование широко применяемого в фармацевтической промышленности, высокочувствительного и надежного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектором. Способ определения -ацетилкарнитина включает отбор пробы, растворение образца субстанции, ГЛФ или БАД в среде растворения, фильтрацию полученного раствора через мембранный фильтр, качественное и/или количественное определение -ацетилкарнитина методом ВЭЖХ с детекцией при длине волны 21020 нм. В качестве растворителя испытуемого образца используют предпочтительно дистиллированную (деионизованную) воду, но возможно использование низкомолярных фосфатных или иных буферных растворов сот 2 до 7. В качестве стандартного образца используют -ацетилкарнитин (кат.00985 , 6706 или аналогичного качества). Используются стандартные условия хроматографирования, хорошо известные специалистам. Наиболее предпочтительны следующие условия хроматографирования колонка, заполненная силикагелем октадецилсилильным (-18) для хроматографии (например,-18 4,6250 ,3,5 или аналогичная) температура колонки от 25 до 30 С. Используется линейноступенчатый градиент из двух подвижных фаз, одна из которых представляет собой водный раствор анионного ПАВ с 2,51, вторая - органическая, предпочтительно ацетонитрил. В качестве ПАВ предпочтительно использовать додецилсульфат натрия в концентрации от 1 до 5 мМ либо иной близкий по свойствам анионный ПАВ, применяемый в ВЭЖХ (например, децилсульфат натрия). Регистрация сигнала спектрофотометрического детектора ведется при длине волны 21020 нм. Метод является удобным, характеризуется высокой степенью безопасности, позволяет удешевить анализ субстанции, ГЛФ, БАД на основе -ацетилкарнитина, а также полупродуктов, использующихся при их производстве. Пример 1. Качественный и количественный анализ -ацетилкарнитина в субстанции фирмы 10. Испытание проводят методом жидкостной хроматографии согласно ГФ РБ т.1, п. 2.2.29 11. Раствор сравнения стандарта -ацетилкарнитина и испытуемый раствор субстанции -ацетилкарнитина готовят в концентрации 1,6 мг/мл путем растворения навесок соответствующих веществ в деионизованной воде. Аликвоты растворов перед хроматографированием фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не менее 0,45 мкм. В качестве подвижных фаз используют 5 мМ раствор додецилсульфата натрия в воде,2,5 ( доводится фосфорной кислотой) и 100 ацетонитрил. Анализ проводят на хроматографе 1200 при следующих условиях колонка -18 размером 2504,6 мм,3,5 мкм температура колонки 25 С скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин детектирование при длине волны 210 нм изменение состава подвижной фазы - линейный градиент от 25 до 40 ацетонитрила в течение 5 мин и изократический режим при 40 ацетонитрила в течение следующих 10 мин объем вводимой пробы - 20 мкл. Применение заявляемого метода позволяет определить присутствие -ацетил-карнитина в субстанции (пик на хроматограмме испытуемого раствора, совпадающий по времени удерживания с пиком на хроматограмме стандарта). Найденное количество 3 17743 1 2013.12.30 ацетилкарнитина в субстанции заявляемым методом - 98,170,26 , методом ВЭЖХМС - 98,230,18 , по данным аналитического листа производителя 10 - не менее 98(таблица). Пример 2. Качественный и количественный анализ -ацетилкарнитина в фармацевтической композиции для энтерального применения (раствор для приема внутрь), содержащей 600 мг -ацетилкарнитина, фруктоза - 100 мг, растворитель (вода очищенная) - до 15 мл. Испытание проводят методом жидкостной хроматографии согласно ГФ РБ т.1,п. 2.2.29 11. Условия хроматографирования, используемые буферный раствор и раствор сравнения соответствуют описанным в примере 1. Испытуемый раствор готовят следующим образом 2 мл раствора фармацевтической композиции для энтерального применения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл деионизованной воды,тщательно перемешивают и доводят водой до метки. Аликвоту фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм. Заявляемый метод позволяет подтвердить присутствие -ацетилкарнитина в композиции для энтерального применения (пик на хроматограмме испытуемого раствора, совпадающий по времени удерживания с пиком на хроматограмме стандарта). Результаты количественного определения приведены в таблице. Образец фармкомпозиции по вышеуказанной прописи содержит 40 мг -ацетилкарнитина в 1 мл. Заявленным методом было найдено 39,80,41 мг (правильность определения 99,5 ), методом ВЭЖХ-МС 40,230,39 мг (правильность определения 100,6 ). Таким образом, правильность определения заявляемым методом количества -ацетилкарнитина в композиции для энтерального применения находится в пределах 98-102 , что не уступает критериям приемлемости известных методов определения, но позволяет анализировать -ацетил-карнитин в фармацевтичекой композиции более удобным и дешевым способом. Пример 3. Качественный и количественный анализ -ацетилкарнитина в фармацевтической композиции для энтерального применения (капсулы), содержащей 200 мг -ацетил-карнитина и вспомогательные вещества лактоза - 48 мг, кальция стеарат - 2 мг. Испытание проводится методом жидкостной хроматографии согласно ГФ РБ т.1,п. 2.2.29 11. Условия хроматографирования, используемые буферный раствор и раствор сравнения соответствуют описанным в примере 1. Испытуемый раствор готовят следующим образом 100 мг содержимого капсул помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл деионизованной воды, тщательно перемешивают, встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Доводят водой до метки. Полученному раствору дают отстояться. Аликвоту надосадочной жидкости фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм. Заявляемый метод позволяет подтвердить присутствие -ацетилкарнитина в фармацевтической композиции (капсулы) для энтерального применения (пик на хроматограмме испытуемого раствора, совпадающий по времени удерживания с пиком на хроматограмме стандарта). Результаты количественного определения приведены в таблице. Образец фармкомпозиции по вышеуказанной прописи содержит 200 мг -ацетилкарнитина в капсуле. Заявленным методом было найдено 198,71,52 мг (правильность определения 99,3 ), методом ВЭЖХ-МС - 199,01,45 мг (правильность определения 99,5 ). Таким образом, правильность определения заявляемым методом количества -ацетил-карнитина в фармацевтической композиции (капсулы) для энтерального применения находится в пределах 98-102 , что не уступает критериям приемлемости известных методов определения, но позволяет анализировать -ацетилкарнитин более удобным и дешевым способом. 4 17743 1 2013.12.30 Результаты количественного определения -ацетилкарнитина в образцах заявленным методом и методом ВЭЖХ-МС Анализируемый образец Количество Количество -ацетил- Количество -ацетил-ацетилкар- -карнитина, опреде- -карнитина опреденитина, присутст- ленное заявляемым ленное методом вующее в образце методом ВЭЖХ ВЭЖХ Субстанция -ацетил-карнитина Фармацевтическая композиции для энтерального применения(раствор для приема внутрь) Фармацевтическая композиция для энтерального применения Заявляемый метод обеспечивает избирательность, линейность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) и правильность. Понятно, что в примерах описано применение заявляемого метода для анализа наиболее применяемых на практике вариантов фармацевтических композиций - ГЛФ и БАД (капсулы, раствор для орального применения) и наиболее доступные вспомогательные вещества. Однако заявляемый метод определения-ацетилкарнитина может быть использован и для анализа других фармацевтических композиций с другими вспомогательными веществами (не ограничиваясь приведенными примерами), которые разрешены к применению и описаны в фармакопеях (например, в таблетках, капсулах, порошках для приготовления растворов для приема внутрь, назальных спреях). Заявляемый метод может использоваться также и в других отраслях промышленности,помимо фармацевтической и пищевой промышленности, например в химическом производстве (при получении -ацетилкарнитина из карнитина методом ацетилирования) 12. Источники информации 1. Интернет-портал ООО ПИК-ФАРМА Электронный ресурс. - М., 2006. Режим доступа //// - Дата доступа 24.07.2010. 2./ - ,, 2009. -//// -25.07.2010. 3...-, 17743 1 2013.12.30 7...//. - 1994. - . 40. - . 817-821. 8..//. - 1986. - . 156. - . 1.- . 111-117. 9...////.256504. -25.07.2010. 10..,./ - , , ,2008 - 2009. -///-д- .25.07.2010. 11. Государственная Фармакопея Республики Беларусь (1 издание) // Ред. Годовальников Г.В. - Молодечно, 2009. 12..//1. - - . - 2003. - . 30. - . 397-442. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6