Способ профилактики гиперплазии стенки имплантированного венозного графта

тивации пролиферативно-активных Клеток 5-аминолевулиновую кислоту в концентрации от 0,6 до 1,2 мМ И фенантролин в Концентрации 0,75 мМ, инкубируют 15 мин, освещают в течение 5 мин светом слайд-проектора с лампой КГМ 150 Вт, после чего снимают лигатуры и промывают полученный графт в свежем физиологическом растворе.4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что освещают светом в диапазоне длин волн от 360 до 760 нм.Изобретение относится к сосудистой хирургии и может быть использовано при операциях шунтирования для фотоинактивации (разрушения, лизиса) пролиферативноактивных гладкомь 1 шечнь 1 х клеток стенки имплантированного венозного графта и увеличения сроков функционирования венозного шунта в артериальных позициях.Наиболее близким по сущности и достигаемому результату является способ профилактики гиперплазии стенки вены, принятый за прототип 1. Способ осуществляется путем введения животному (кролик) гепарина, извлечения из сосудистого русла участка вены (графта), промывания изолированного графта физиологическим раствором, содержащим гепарин и папаверин, клиппирования его концов после заполнения этим раствором,помещения графта в 0,01 раствор индуктора фотоинактивации клеток (метиленовый синий), охлаждения раствора метиленового синего с графтом до 2 С, освещения при постоянном перемешивании раствора метиленового синего с графтом в течение 5 минут светом слайд-проектора (1000 Вт) при 2 С, промывания освещенного графта физиологическим раствором, содержащим гепарин и папаверин, имплантации графта в артериальное русло животного, извлечения через 4 недели после операции нативного и освещенного(фотооксидированного) графта из сосудистого русла животного для сравнительного гистологического и морфологического анализа состояния стенки вены.Недостатками известного способа являются использование животных весом до 3,5 кг(кролики), необходимость заполнения графта специально приготовленным раствором, содержащим спазмолитик (папаверин) и антикоагулянт (гепарин), проведение процедуры охлаждения раствора с графтом до 2 С, применение метиленового синего - препарата,обладающего сосудосуживающим эффектом, ингибирующего расслабление гладкомь 1 шечных клеток сосуда 2, неспецифически взаимодействующего с разными популяциями клеток сосудистой стенки, что может приводить к повреждению при освещении светом не только пролиферативно-активных гладкомышечных клеток, но и функционально значимых клеток стенки вены, таких как эндотелиоциты, изменение функционального состояния которых может способствовать разрастанию и формированию неоинтимы, индуцировать агрегацию тромбоцитов и, соответственно, тромбоз сосуда 3.Задачей изобретения является поиск новых препаратов для сосудистой хирургии, увеличивающих чувствительность пролиферативно-активных клеток венозного графта к свету, обладающих избирательным в них накоплением, способных индуцировать фотоповреждение и фотоинактивацию гладкомышечных (пролиферативно-активнь 1 х) клеток стенки вены, повышающих эффективность процесса фоторазрушения клеток 111 5111, а также упрощение метода, увеличение продолжительности функционирования аутоимплантатовРезультат достигается тем, что в способе профилактики гиперплазии стенки имплантированного венозного графта, включающем введение животному гепарина, извлечение участка венозного сосуда необходимой длины из сосудистого русла, заполненного кровью, клиппирование его концов, помещение графта в физиологический раствор, содержащий индуктор фотоинактивации клеток, инкубацию, освещение сосуда источником света с лампой 150-300 Вт, имплантацию освещенного графта в сосудистое русло животного,в качестве индуктора фотоинактивации пролиферативно-активных клеток используют 5-аминолевулиновую кислоту (АЛК). В соответствии с одним из аспектов изобретенияосвещение венозного графта светом осуществляют при комнатной температуре (2015 С). В физиологический раствор можно дополнительно вводить один или более хелатирующих металлы соединений (о-фенантролин, ЭДТА, 2,2-дипиридил и др.). Освещение проводят с внешней поверхности участка венозного сосуда в Диапазоне длин волн 360-760 нм. Проходимость и функциональная активность освещенного после инкубации с индуктором фотоинактивации и имплантированного в кровеносное русло венозного графта сохраняется при любом его размере (длина более 4 см, диаметр более 3 см). Освещеннь 1 й после инкубации с индуктором фотоинактивации клеток участок сосуда функционирует в условиях 111 уйуо продолжительное время.Основным следствием поступления к клеткам АЛК является ее превращение через ферментативный путь в предшественники синтеза гема - порфирины, в частности в протопорфирин 1 Х (ПП), обладающий высокой фотодинамической активностью. Процесс этот детально исследован и описан в работах 4, 5. Индуцируемое АЛК накопление эндогенного ПП наиболее выражено в пролиферативно-активнь 1 х, незрелых, бластных клетках, а также в вирус- и злокачественно трансформированных клетках 6. В последнее время фотодинамическая активность эндогенных порфиринов находит все больщее применение в медицинской практике, уже используется в диагностике и фотодинамической терапии злокачественных новообразований и других заболеваний 7. АЛК обладает рядом преимуществ по сравнению с известными индукторами фотоинактивации клеток, в частности метиленовым синим, мероцианином 540 и другими. АЛК хорощо растворима в воде, легко проникает через плазматическую мембрану в клетку, избирательно запускает в биоактивных клетках синтез эндогенных фотосенсибилизаторов порфириновой природы,которые накапливаются в этой клетке, при этом вероятность фотоповреждения остальных клеток сосудистой стенки значительно снижается. Из литературных источников неизвестно использование АЛК в сосудистой хирургии вообще и, в частности, для профилактики гиперплазии стенки имплантированного венозного графта.Способ осуществляют следующим образом. Животному под наркозом проводят внутривенную гепаринизацию ( 1,5 мг/кг веса), затем из сосудистого русла извлекают участок венозного сосуда, проксимальные и дистальные концы которого клиппируют. При комнатной температуре изолированный сосуд помещают в физиологический раствор, содержащий АЛК в концентрации 0,6-1,2 мМ (рН 7,4), выдерживают в этом растворе для накопления в пролиферативно-активных клетках стенки вены ПП, в этом же растворе освещают светом слайд-проектора в течение 3-5 минут, причем интенсивность светового потока может быть от 35 Вт/м 2 и выще. Сразу после освещения венозный графт переводят в свежий физиологический раствор, с концов снимают лигатуры и фотооксидированный участок сосуда имплантируют в венозное или артериальное русло животного. При воздействии света в клетках-мишенях (пролиферативно-активнь 1 х), накопивших в присутствии АЛК эндогенные порфирины, происходит фотохимическая реакция, в результате которой они фотоинактивируются и впоследствии гибнут. Через 3 и более месяцев после Шунтирования проводят визуальную оценку состояния имплантированного участка вены, определяют его проходимость и методом микроскопии и морфометрии анализируют состояние стенки сосуда.В качестве контроля предлагаемого способа использовали имплантированный в артериальное русло собаки венозный графт, который не подвергали воздействию индуктора фотоинактивации клеток и света, а также венозный графт, имплантированный после дополнительной обработки по указанному выще способу, но без внесения в физиологический раствор индуктора фотоинактивации клеток.В таблице представлены результаты микроскопии гистологических препаратов по предлагаемому способу и способу-прототипу.Микроскопическо-морфометрический анализ состояния венозных сосудов, имплантированных в артериальное русло Инд КВремя у тор фо- Длина Время после Не Образцы о освег С тоинак- графта, операции, Морфология Морфометрия п/п сосудов щения,тивации см мес. мин клеток Проходимость сосуда сохранена. неосвещен- В неоинтиме и частично в медии 1 нь 1 й сосуд 20 О определяются гладкие миоциты Площадь неоинтимы(контроль (а-ЗМ асгш положительные), большое 1,94 О,6 мм 2 прототипа) количество пролиферативно активных клеток (РСЫА-положительные). 2 Проходимость сосуда сохранена. освещенный метила В неоинтиме и частично в медии сосуд определяются гладкие миоциты Площадь неоинтимы 2 5 новыи . 2(способ СИНИЙ (а-ЗМ асгш положительные), колиЧе- О,57 О,2 мм прототипа) ство РСЫА-положительных клеток значительно меньще. неосвещен- Оп еделяется обт и ющий о гани р ур ру р Интима по всему пень 1 и сосуд зованныи тромб с незначительнои риметру сосуда заме(контроль реканализациеи, с разрастанием 3 20 - - 5 3 щена соединительнои предлагае- соединительнои ткани на среднюютканью. Толщина не мого спосо- оболочку. Эндотелиоциты практичеоинтимь 1 37,4139 мкм ба) ски отсутствуют. Проходимость сосуда сохранена. освещенный Эндотелиоциты уплощены, сохранесос д (ва и ны на всем п отяжении п освета Толщина ИНТИМЫ у р р р 2,410,2 мкм (Р 0,О 1). 4 ант предла- 20 5 АЛК 5 3 сосуда. Интима утолщена равномер Толщина неоинтимы гаемого но. В неоинтиме и частично в медии 18 НЗ О МКМ способа) определяются гладкие миоцитыМорфометрия проводилась с помощью вычислительной системы обработки и анализа изображения (Ье 1 са, Германия) при увеличении 400 в 5 полях зрения по всему периметру каждого графта (в каждом поле зрения - по 10 измерений), р 0,05.Тромбоза графтов, освещенных после инкубации с АЛК через 2 и более месяцев, не наблюдалось, и их проходимость сохранялась на всем протяжении имплантата.Используемые параметры морфометрического анализа, в частности определение толщины неоинтимы сосудистой стенки, более Корректны по сравнению с регистрацией площади неоинтимы, проведенной в методе протопита, т.к. толщина неоинтимы не зависит от диаметра оцениваемого сосуда.Собаке весом 20 кг проводят гепаринизацию ( 1,5 мг/кг веса), под общим наркозом вь 1 деляют участок (графт) бедренной вены, заполненный кровью, проксимальные и дистальные концы которого клиппируют. Венозный графт помещают на 20-30 минут в стеклянную емкость, содержащую физиологический раствор с АЛК в концентрации 0,8-10 мМ,затем венозный графт освещают в этом растворе в течение 5 минут светом слайдпроектора Пеленг 500 К (лампа КГМ, 150 Вт). Сразу после освещения с венозного графта снимают лигатуры и имплантируют его в артериальное русло собаки (сонная артерия). Контрольный венозный графт инкубируют в физиологическом растворе без АЛК и не освещают. Через 3 месяца после постановки животного в эксперимент оценивают состояние имплантированных участков венозных сосудов, их проходимость и проводят морфометрический анализ сосудистой стенки.Способ осуществляется по примеру Не 1, но в физиологический раствор совместно с АЛК вносят 0,75 мМ фенантролина (хелатор металлов). При этом время, необходимое для достижения результата, сокращается до 15 минут.Поскольку последовательное воздействие АЛК и света на сосудистые графты длиной и диаметром более 3 сантиметров замедляет процесс формирования неоинтимы, образования тромбов, способствует сохранению функциональной активности имплантатов в течение длительного времени, предлагаемый способ может быть рекомендован к использованию в клинической практике при операциях аутовенозного шунтирования.Таким образом, индуктор фотоинактивации клеток - АЛК может быть использован для профилактики гиперплазии стенки венозных графтов, имплантированных в кровеносное русло. Способ профилактики гиперплазии стенки имплантированного венозного графта упрощен за счет исключения процедуры внутривенного введения папаверина, заполнения графта аутокровью, а не специально приготовленным физиологическим раствором, содержащим спазмолитики и антикоагулянты, исключения процедуры охлаждения графта, увеличения продолжительности функционирования венозных имплантатов в сосудистом русле.1. Ке-Хйап Ыи, РишйоУашашого, 5 аго 5111 5 е 11 пе а а 11. 111111 Ьпогу Ейесг оГ Ме 11 у 1 епе Вше-Шбисеб Рпогоохйбайоп оп 1 ш 1 ша 1 Т 111 с 1 еп 1 п 3 оГ Уейп Стай Апп Т 11 огас 5 иг 31999, 68,Р. 84-88.