Пептиды, обладающие антикоагулянтным действием

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(73) Патентообладатели Голубович Владимир Петрович, Мартинович Вера Павловна(57) Пептиды общей формулы , где -- (-аминокапроновая кислота) или Настоящее изобретение относится к пептидам антикоагулянтного действия - структурным аналогам концевого сегмента А-цепи фибрина, которые регулируют процессы полимеризации фибрина и тромбообразования и могут быть использованы как препараты, подавляющие процесс свертывания крови. Известны ингибиторы тромбообразования пептидной природы. Так, -концевой сегмент А-цепи фибрина способен избирательно связываться с определенными участками молекулы фибриногена и блокировать процесс фибринообразования 1,2. Добавление к этой последовательности аминокислотного остатка пролина или саркозина значительно увеличивает связывающую и ингибирующую активность является наиболее активным ингибитором полимеризации фибрина из всех пептидных соединений, исследованных Лаудано и Дулитлом / 2 /. С учетом данных о потере активности при модификации аминоконца и важности конформационного состояния пептидов, связывающихся с фибриногеном 1,2, были синтезированы и исследованы аналоги , удлиненные с С-конца остаткомили . Активность и превышает активность тетрапептида в 2-3 раза при молярном соотношении фибриноген-пептид 150. Предполагается, что остаткиилив пятом положении оптимально стабилизируют структуру пептида, а дополнительная Н 2-п способствует его взаимодействию с белком. Однако в исследованиях на плазме крови обнаружено, что действие этих пептидов непродолжительно, они проявляют активность в течение 30-60 минут. Задачей настоящего изобретения является получение соединений с антикоагулянтной активностью общей формулы (1), где --АК- (-АК-аминокапроновая кислота) или -, или -, ингибирующие процесс полимеризации фибрина в плазме крови или русле кровопотока, проявляющие действие в течение 60-120 минут. Проведенная модификация - удлинение пептидной цепи, в том числе за счет введения дополнительных метиленовых звеньев, позволила получить соединения с высокой антикоагулянтной активностью и пролонгированного действия, которые проявляют свою активность не тольков модельной системе тромбин-фибриноген, но и в плазме крови. Теоретический конформационный анализ этих пептидов 2925 1 показал, что у всех их сохранена биологически активная конформация, необходимая для связывания с фибриногеном, проведенные по С-концу модификации дополнительно стабилизируют эту конформацию. Пептиды с С-концевым аргинином (, ) получают последовательным присоединением активированных эфиров- защищенных аминокислот или дипептидов к С-концевым фрагментам, используя внутреннее солеобразование карбоксила и гуанидиновой группы аргигина для блокирования реакционной способности гуанидиновой группы. При синтезе также используют присоединение активированных эфиров- бензилоксикарбониламинокислот или , ,- трибензилоксикарбониларгинина к растущей пептидной цепи с С-концевым пролином. Бензилоксикарбонильную группу удаляют гидрированием в метаноле над 10 палладием, осажденным на угле. Пептиды на этой стадии получают со свободными непротонированными аминогруппами, что позволяет сразу использовать их в реакциях конденсации с активированными эфирами. Синтез по разработанным схемам позволяет получать целевые пептиды с минимальным числом стадий и высокими постадийными выходами. Процессы синтеза, удаления защитных групп и индивидуальность полученных соединений контролируют тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленным слоем силикагеля (Мерк, ФРГ), а также электрофорезом на бумаге ФН-12 (Фильтрак, ФРГ) при градиенте потенциала 30 в/см в 2 -ой уксусной кислоте(рН 2,6). Электрофоретическую подвижность определяют по отношению к гистидину,Приведены хроматографические подвижности в системах (А) - н.бутанол - уксусная кислота - вода, 311(Б)- этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода, 6020611 (В) - н.бутанол - уксусная кислота - пиридин - вода, 3062024, (Г) - бензол - этилацетат - уксусная кислота, 100502 (Д) - н.бутанол - уксусная кислота - пиридинвода, 6112- н.бутанол - уксусная кислота - вода - этилацетат, 3113. Проявление пластинок хлорбензидиновым методом. Элементный анализ проводят на автоматическом анализаторе 185 В Хьюлетт Паккард. Данные элементного анализа полученных соединений соответствуют вычисленным значениям. Аминокислотный анализ пептидов, гидролизированных в запаянных ампулах 6 н НС при 110 С в течение 20 часов, выполняют на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-349 (Чехия). Удельное вращение определяют на автоматическом спектрополяриметре Перкин-Элмер МС 241. Температура плавления определена на приборе Кофлера и проведена без коррекции. Растворы веществ в органических растворителях высушивают безводным 24 и упаривают в вакууме на ротационном испарителе при температуре не выше 40 С. Твердые вещества высушивают в вакуумэксикаторе над КОН и Р 2 О 5. Пример 1. Глицил-пролил-аргинил-пролиламинокапроил-аргинин, диацетат. 1. Бензилоксикарбониламинокапроил-аргинин . К раствору 1, 90 г (4,4 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилоксикарбониламинокапроновой кислоты в 9 мл ДМФА прибавляют 0,61 г (3,55 ммоль) аргинина. После перемешивания в течение 12 часов реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,32 г (86 ) соединения . 20 10,4 (с 1, МеОН)0,50 (А), 0,30 . 2. Бензилоксикарбонилпролиламинокапроил-аргинин . 1,14 г (2,6 ммоль) соединения 1 гидрируют в метаноле над /. После окончания гидрирования (контроль ТСХ) катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 1,18 г(4,4 ммоль) оксисукцинимидного эфира бензилоксикарбонилпролина в 8 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют этилацетатом. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,40 г (95) соединения , 20 -17,2 (с 1, МеОН)0,39 (А), 0,30 (Б). 3. Трибензилоксикарбониларгинил -пролил аминокапроил-аргинин . 0,54 г ( 1 ммоль) соединениягидрируют в метаноле над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,9 г (1,25 ммоль) пнитрофенилового эфира трибензилоксикарбониларгинина в 7 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15 х 50 мм с суспензией силикагеля 40/100 в хлороформе. Затем колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют продукт смесью хлороформа с метанолом с повышающимся содержанием спирта от 20 до 40 . Объединенные фракции, содержащие целевой продукт, упаривают и осаждают эфиром. Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,58 г (60 ) соединения ,20 - 41,7 (с 1, МеОН)0,54 (А), 0,23 (Б). 4. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролиламинокапроил-аргинин . 0,12 г (0,12 ммоль) соединениягидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха и к остатку добавляют раствор 0,08 г (0,17 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилоксикарбонилглицилпролина в 1 мл ДМФА. Через 2 часа реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,09 г (0,12 ммоль) (100 ) соединения , 20 - 55,0 2925 1 5. Глицил-пролил-аргинил-пролиламинокапроил-аргинин, диацетат . 0,058 г (0,07 ммоль) соединениягидрируют в 5 мл метанола с добавкой нескольких капель уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают раствор упаривают до малого объема и разбавляют сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,057 г (100 ) соединения , 20 -50,2 (с 1, МеОН)0,30 (В), Е 1,00. Данные аминокислотного анализа глицин 1,00 (1), аргинин 1,98 (2), пролил 1,92 (2). Пример 2. Глицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин. 1. Трибензилоксикарбонил-аргинил-пролин . 0,40 г (3,6 ммоль) пролина растворяют в 3,6 млн.и прибавляют раствор 1,7 г (2,4 ммоль) .- в 8 мл диоксана. Через сутки диоксан упаривают в вакууме, остаток подкисляютн. НС 1. Выпавшее масло экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают водой, насыщенным раствором , сушат, упаривают. Полученное масло массой 1,6 г (100 ) хроматографически однородное. 20 - 58,1 (с 1, МеОН)0,42 (Г). Т. пл. дициклогекси-ламмониевой соли 119-121 С. 2. Бензилоксикарбонилпролил-аргинин-пролин (а). 1,6 г (2,4 ммоль) соединениягидрируют в метаноле над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку добавляют раствор 1 г (2,9 ммоль) в 7 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15 х 50 мм с суспензией силикагеля 40/ в хлороформе. Затем колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют смесью хлороформа и метанола с повышающимся содержанием спирта от 20 до 40 . Объединенные фракции, содержащие целевой продукт,упаривают и осаждают эфиром. Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,84 г (70 ) соединения а, 20 - 80,3 (с 1, МеОН)0,30 (А), 0,56 (В). 3. Трибензилоксикарбониларгинил-пролил-аргинил-пролин (а). 0,4 г (0,8 ммоль) соединения а гидрируют в метаноле над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,7 г (1 ммоль) 3 - в 5 мл ДМФА. Через сутки реакционную смесь разбавляют этилацетатом, содержащим 10 н.бутанола, и промывают водой. Органический слой упаривают до малого объема и прибавляют эфир. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15 х 50 мм с суспензией силикагеля 40/100 в хлороформе. Колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют продукт смесью хлороформа с метанолом (41). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, содержимое высаждают эфиром. Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,45 г (60 ) соединения а, 20 - 70,6 ( с 1, МеОН)0,40 (А), 0,23 (Б), 0,49 (В). 4. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин . 0,25 г (0,27 ммоль) соединения а гидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,17 г (0,35 ммоль) в 6 мл ДМФА. Через сутки реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают, высушивают и обрабатывают смесью 10 мл хлороформа и 12 мл воды. Водный слой, содержащий целевой продукт,отделяют и упаривают досуха с изопропиловым спиртом. Получают 0,20 г (92 ) соединения а, 20 - 32,3 (с 1, МеОН)0,46 (В). 5. Глицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин, диацетат (а). 0,20 г (0,25 ммоль) соединениягидрируют в метаноле с добавлением уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают до малого объема и добавляют сухой эфир. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,20 г соединения ,20 - 91,9 (с 1, )0, (В). Данные аминокислотного анализа глицин 1,00 (1), пролин 2,85 (3), аргинин 2,05 (2). Пример 3. Глицил-пролил-аргинил-пролилаланил-аргинин, диацетат. 1. Трет. бутилоксикарбонилаланил-аргинин (1 б). К раствору 1,4 г (4 ммоль) пентафторфенилового эфира трет. бутилоксикарбонилаланина в 7 мл ДМФА прибавляют 0,52 г (3 ммоль) аргинина. После перемешивания в течение 12 часов реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,04 г(100 ) соединения 1 б, 206,3 ( 1, )0,39 , 0,60 (В). 2. Бензилоксикарбонилпролилаланил-аргинин (б). 0,7 г (2 ммоль) соединения б растворяют в 7 мл ледяной уксусной кислоты и прибавляют равный объем 2 н. /. После выдерживания в течение часа при комнатной температуре реакционную смесь упаривают, остаток обрабатывают сухим эфиром. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают. Затем вещество растворяют в небольшом количестве метанола и раствор обрабатывают ионообменной смолой ДАУЭКС 1 х 8 в ОН форме до отрицательной реакции на ион С. Смолу отфильтровывают, раствор упаривают досуха и к остатку прибавляют раствор 0,86 г (2,5 ммоль) -Рго- в 6 мл ДМФА. Смесь перемеши 3 2925 1 вают 24 часа, разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,9 г (95 ) соединения б, 20 - 6,1 (с 1, )0,42 (А), 0,53 (В). 3. Трибензилоксикарбониларгинил-пролилаланил-аргинин (б). 0,48 г (1 ммоль) соединения б гидрируют в метаноле над /. После отделения катализатора раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,9 г (1,25 ммоль) в 6 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15 х 50 мм с суспензией силикагеля 40/100 в хлороформе. Затем колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют продукт смесью хлороформа с метанолом с повышающимся содержанием спирта от 20 до 40 . Объединенные фракции, содержащие целевой продукт упаривают и обрабатывают эфиром. Полученный аморфный порошок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,55 г (60 ) соединения б, 206,6 (с 1, МеОН)0,54 (А), 0,21 (В). 4. Пентафторфениловыйэфир бензилоксикарбонилглицил-пролина (б). К раствору 0,31 г (1 ммоль) Рго в 5 мл ДМФА, охлажденном до 0 С, прибавляют 0,76 г (1 ммоль) комплекса . Реакционную смесь перемешивают 10 мин и оставляют на 24 часа при комнатной температуре, затем разбавляют этилацетатом, отфильтровывают дициклогексилмочевину, раствор промывают 53, водой, насыщенным раствороми высушивают безводным 24. После упаривания оставшееся масло закристаллизовывают под гексаном. После кристаллизации из смеси этилацетата с гексаном получают 0,38 г (80 ) соединения б, Т. пл. 79-81 С, 20 - 13,4 (с 1, ДМФА)0,69 (Г). 5. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролил- -аланил-аргинин (б). 0,11 г (0,12 ммоль) соединения б гидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха и к остатку прибавляют раствор 0,07 г (0,15 ммоль) соединения б в 1 мл ДМФА. Через 24 ч реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,095 г (100 ) соединения б, 20 -42,9(с 1, )0,39(Б), 0,23 (Д). 6. Глицил-пролил-аргинил-пролилаланил-аргинин, диацетат (б). 0,08 г (0,1 ммоль) соединения б гидрируют в метаноле с добавкой уксусной кислоты над /. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают до малого объема и разбавляют сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,07 г (100 ) соединения б,20 - 31,5 (с 1, МеОН)0,95 (В), Е 1.00. Данные аминокислотного анализа глицин 1,00 (10, аргинин 2,04 (2), пролин 1,94 (2). Эксперименты по изучению антикоагулянтного действия пептидов были проведены в условиях(в системе фибриноген-тромбин) и на плазме крови человека, полученной со станции переливания крови. Следует отметить, что в модельной системе все ранее изученные нами пептиды проявляли существенную активность, которая заметно падала в плазме крови в связи с деградацией их под действием пептидов, поэтому эксперименты на плазме крови были определяющими для выявления физиологически активных препаратов. В опытах использовали плазму, полученную центрифугированием из цитратсодержащей крови человека. Концентрацию фибриногена в плазме определяли методом Бидвела. Исследуемые пептиды добавляли в молярном соотношении к белку 1001. В контроле к плазме добавляли соответствующий объем цитратного буфера. Время свертывания после добавления в плазму раствора тромбина в концентрации 0,1 наблюдали по изменению мутности на спектрометре при 350 нм. Среди рассмотренных пептидов нами были обнаружены три препарата, которые проявляют антикоагулянтную активность в течение двух часов после введения, в отличие от ранее полученных соединений, которые сохраняли активность в плазме крови в течение 30-60 минут. Результаты испытаний , , представлены в таблице. Время после введения пептида в плазму крови/мин 30 60 2,80,3 1,40,2 3,00,3 2,60,3 3,00,3 1,90,2 Представленные в таблице величины являются соотношением времен свертывания крови в присутствии пептида и без него при добавлении тромбина. Как видно из таблицы, пептид проявляет наибольшую активность при введении в плазму, а пептид Рго наиболее устойчив к действию пептидаз. По сравнению с известным антикоагулянтом прямого действия гепарином заявляемые пептиды обладают более мягким физио 4 2925 1 логическим действием, целенаправленно влияют на свертывающую систему крови и легко выводятся из кровотока за счет собственных ресурсов организма. Данные соединения обладают низкой токсичностью. При внутривенном введении препаратов белым беспородным мышам летальная доза не была достигнута даже при соотношении 0,1 г на 1 кг живого веса, что превышает терапевтические дозы на несколько порядков. Представленные пептиды могут найти применение в медицине при трансфузии, гемодиализе, гемосорбции, а также, возможно, и в хирургической практике. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.