Способ исследования кислородного обмена в эритроцитах

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КИСЛОРОДНОГО ОБМЕНА В ЭРИТРОЦИТАХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Автор Титовец Эрнст Петрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Способ исследования кислородного обмена в эритроцитах, заключающийся в том, что эритроциты разводят изотоническим раствором , помещают в снабженную кислородным сенсором полярографическую ячейку, одна из стенок которой выполнена в виде газопроницаемой мембраны, создают на газопроницаемой мембране градиент парциального давления кислорода в заданном направлении путем пропускания через нее газовой смеси с заданным парциальным давлением кислорода, и по регистрируемой кинетике содержания кислорода в ячейке исследуют кислородный обмен в эритроцитах. 14224 1 2011.04.30 Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к функциональным и кинетическим методам исследования кислородного обмена эритроцитов, и может быть применено при количественной оценке кислородтранспортной функции эритроцитов в норме и при патологии, количественной оценки воздействия на эритроциты различных физических факторов (лазерного излучения, магнитных полей и др.), оценки регулирующего действия фармакологических средств на кислородный обмен эритроцитов и их газотранспортную функцию. Известен способ исследования кислородного обмена эритроцитов, согласно которому скорости выноса кислорода из эритроцитов определяют в полярографической ячейке закрытого типа, куда вместе с эритроцитами помещают дрожжи, которые поглощают кислород, чем обеспечивается градиент парциального давления кислорода на эритроцитарной мембране, при котором эритроциты отдают кислород во внешний раствор. Скорость выноса кислорода из эритроцитов определяют по разнице между наблюдаемой скоростью падения кислорода в растворе и определенной предварительно скоростью поглощения кислорода собственно дрожжами 1. Однако известный способ обладает рядом принципиальных недостатков, связанных с использованием дрожжей в качестве поглотителя кислорода. Хотя он позволяет исследовать процесс десатурации эритроцитов, однако он в принципе не обеспечивает возможности исследования скорости обратного процесса - насыщения эритроцитов кислородом. Известный способ делает проблематичной и даже исключает возможность исследования действия на кислородный обмен эритроцитов фармакологических и других средств, поскольку они одновременно могут воздействовать и на дыхательную активность дрожжей. Использование дрожжей - лабильного биологического объекта - не обеспечивает достаточно высокую точность измерений. Задача изобретения состоит в разработке технологии количественного определения скоростей кислородного обмена эритроцитов, исключающей применение дрожжей или других биологических способов поглощения кислорода, определении не только скоростей выноса кислорода из эритроцитов, но и его поглощения эритроцитами, обеспечении возможности исследования действия фармакологических и других средств на кислородный обмен эритроцитов. Сущность способа исследования кислородного обмена в эритроцитах заключается в том, что эритроциты разводят изотоническим раствором , помещают в снабженную кислородным сенсором полярографическую ячейку, одна из стенок которой выполнена в виде газопроницаемой мембраны, создают на газопроницаемой мембране градиент парциального давления кислорода в заданном направлении путем пропускания через нее газовой смеси с заданным парциальным давлением кислорода, и по регистрируемой кинетике содержания кислорода в ячейке исследуют кислородный обмен в эритроцитах. Технический результат изобретения заключается в том, что, кроме исследования процесса десатурации, появляется возможность исследовать процесс сатурации эритроцитов,расширяется объем получаемой информации о кислородном обмене и кислородтранспортной функции эритроцитов, повышается точность измерений, обеспечиваются возможность исследования действия на кислородный обмен эритроцитов фармакологических и биологически активных соединений, что имеет важное как научное, так и практическое значение. Изобретение поясняется фотографией, схемой и диаграммами, представленными на фиг. 1-4. На фиг. 1 представлена принципиальная схема устройства для исследования кинетики оксигенации и дезоксигенации эритроцитов, где 1 - измерительная камера, куда помещают раствор и эритроциты 2 - газообменный модуль с каналами для циркуляции газов (3 и 6) 4 - мембрана, проницаемая к кислороду 5 - микромешалка 7 - микроканал для внесе 2 14224 1 2011.04.30 ния различных добавок 8 - электромотор мешалки 9 - монтажный блок 10 - кислородный микросенсор кларковского типа. На фиг. 2. представлен общий вид устройства для исследования кислородного обмена эритроцитов и их газотранспортной функции, где 1 - кислородный микросенсор 2 - монтажный блок 3 - измерительная камера для помещения исследуемых эритроцитов 4 - газообменный модуль 5 - микромешалка. Кислородный микросенсор подключают к полярографу, который в свою очередь через аналого-цифровой преобразователь подключен к персональному компьютеру. Результаты измерений выводятся на дисплей компьютера и запоминаются в виде бинарных или текстовыхфайлов для последующей программной обработки. Изобретение используют следующим образом 1. Регистрируют последовательно кинетические кривые падения содержания кислорода и его возрастания в измерительной камере при пропускании через газообменный модуль соответственно азота и кислорода (фиг. 3). На фиг. 3 представлены кинетические кривые падения и возрастания содержания кислорода в измерительной камере при пропускании через газообменный модуль азота или кислорода. В измерительной камере физиологический раствор , 0/9 . 2 -пропускание через газообменном модуле азота 2 - пропускание через газообменный модуль кислорода. Объем измерительной камеры 250 мкл. Температура 26 С. 2. В измерительную камеру помещают эритроциты и регистрируют кривую изменения содержания кислорода в условиях его непрерывного поступления (фиг. 4). На фиг. 4 представлен график изменения содержания кислорода в измерительной камере в присутствии эритроцитов в условиях его непрерывного поступления (А) и его первая производная (Б). Эритроциты присутствуют в количестве 2,37106/мкл. Среда измерения представляет собой изотонический раствор . В газообменном модуле находится кислород. Температура 26 С. В - график поступления кислорода в измерительную камеру в отсутствие эритроцитов (фрагмент графика фиг. 3). 3. Определяют скорость поступления кислорода в измерительную камеру по данным фиг. 3 и скорость возрастания кислорода в измерительной камере в присутствии эритроцитов по данным фиг. 4. Скорость связывания кислорода эритроцитами получают путем вычитания из скорости поступления кислорода в измерительную камеру скорости изменения содержания кислорода в присутствии эритроцитов. Определение скоростей осуществляют программным способом путем дифференцирования кривых фиг. 3 и 4 (получение первой производной). Эти расчеты выполняют с использованием, например, программ, ,и др. По данным исследований, представленных на рис. 3 и 4 и расчетов, выполненных в соответствии с описанной выше технологией, скорость оксигенации эритроцитов (или сатурации) в физиологическом диапазоне парциальных давлений кислорода 2-5 кПа составляет из расчета на один эритроцит 36,00,410-9 нмоль/мин (6). При замене кислорода на азот в газообменном модуле аналогичным образом определяют скорости десатурации эритроцитов. Процессы сатурации и десатурации эритроцитов могут быть воспроизведены многократно путем простой замены газа, пропускаемого через газообменный модуль. Полученные данные могут быть подвергнуты другим способам обработки для оценки кислородтранспортной функции эритроцитов. Например, при построении зависимости количества связанного эритроцитами кислорода от его парциального давления получают кривую диссоциации оксигемоглобина. При этом переход от концентрации кислорода к его парциальному давлению осуществляют согласно закона Генри (линейная зависимость между концентрацией и парциальным давлением кислорода). Для исследования действия на процессы транспорта кислорода фармакологических средств вносят в измерительную камеру через микроотверстие (фиг. 1) добавки соответствующих веществ в виде растворов. Очевидно, что в отличие от прототипа, внесение до 3 14224 1 2011.04.30 бавок не влияет на скорость собственно переноса кислорода через газопроницаемую мембрану. Следует заметить, что при замене кислородного микросенсора на микросенсор углекислого газа аналогичным образом можно исследовать скорости эритроцитарного обмена углекислого газа. Источники информации Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5