Способ дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПСОРИАТИЧЕСКОГО АРТРИТА И АНКИЛОЗИРУЮЩЕГО СПОНДИЛИТА(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Кундер Елена Владимировна Генералов Игорь Иванович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56) БЕНДЕЛИАНИ З.Д. Состояние системы гиалуронидаза-гиалуроновая кислота и проницаемости гистогематических барьеров у больных псориазом до и в процессе лечения. Автореферат диссертации.- Тбилиси, 1982.- С. 4-9,26-28. АЗАРЕНОК К.С. и др. Клиническая лабораторная диагностика.- 1994. 5.- С. 38-40.74471 2, 2006. КУНДЕР Е.В. и др. Иммунопатология,аллергология, инфектология.- 2005. 3.- С. 26-34.(57) Способ дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита, заключающийся в том, что смешивают 0,1 мл сыворотки крови больного,разведенной 0,15 М раствором хлорида натрия в 200 или 500 раз, с 0,2 мл гиалуроновой кислоты и 0,1 мл 0,004 М ацетатного буфера с рН 3,8, инкубируют в течение 1 часа при 37 С, после чего наслаивают на поверхность смеси 20 мкл 0,75 -ного раствора риванола, перемешивают встряхиванием и при образовании гомогенной взвеси или хлопьев и нитей диагностируют псориатический артрит, а при образовании компактного или рыхлого сгустка - анкилозирующий спондилит. Изобретение относится к медицине (ревматологии, иммунологии) и может быть использовано для дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита. Общепризнанным фактом являются объективные трудности своевременной верификации спондилоартропатий, в частности псориатического артрита и анкилозирующего спондилита. Для спондилоартропатий до настоящего времени не разработаны четкие диагностические критерии, вследствие чего даже опытными клиницистами допускаются ди 12703 1 2009.12.30 агностические ошибки 1. Также не существует специфических лабораторных критериев спондилоартропатий. Исследования, обладающие доказанной специфичностью в отношении других ревматологических заболеваний (ревматоидного артрита - ревматоидный фактор, обнаружение антител к цитруллинированным пептидам), служат скорее критериями исключения для этих заболеваний. Одним из основных методов лабораторной диагностики спондилоартропатий остается определение -27 2. В последнее десятилетие для диагностики ряда заболеваний предлагают использовать определение различных видов ферментативной активности сыворотки крови. Доказано,что ДНКазная и гиалуронидазная активность сывороток коррелирует с прогрессированием патологических процессов, в частности онкологических заболеваний 3, 4. В свою очередь, оценка гиалуронидазной активности сывороток применяется для оценки тяжести протекания болезней соединительной ткани, значительное увеличение сывороточной гиалуронидазы по сравнению со здоровыми лицами обнаружено при ревматоидном артрите,причем ее уровень наибольший при суставно-висцеральной форме болезни и превышает таковые при болезни Бехтерева, остеоартрозе, подагре 5. Определение сывороточной гиалуронидазной активности для диагностики и дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита до настоящего времени не применялось. Прототипом заявляемого способа дифференциальной диагностики является определение -27 для дифференциальной диагностики между псориатическим артритом и анкилозирующим спондилитом 6. Метод включает несколько стадий получение крови от больного определение антигена -27 в реакции комплемент-зависимого лимфоцитолиза. Недостатком метода является то, что данный способ диагностики является неспецифическим для дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита. Определение антигена -27 не рекомендуется использовать в качестве скринингового теста для диагностики анкилозирующего спондилита в популяции, так как клинические признаки заболевания развиваются только у 15-20 носителей данного антигена. Кроме того, экспрессия -27 характерна для всей группы спондилоартропатий. Например, при анкилозирующем спондилите частота выявления данного антигена равна 90-95 , при псориатическом артрите - 20-40 , а при спондилоартритическом варианте псориатического артрита достигает 50-70 . Также часто выявляется этот антиген и при других заболеваниях при остром переднем увеите - 50 , при артритах, ассоциированных с заболеваниями кишечника, - 30 , при синдроме Рейтера - 602. Задачей изобретения является разработка метода лабораторной дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита на основе определения гиалуронидазной активности сыворотки крови. Сущность изобретения заключается в том, что после забора у больных крови производится отделение сыворотки и определяется ее гиалуронидазная активность методом риванолового сгустка. По окончании кратковременной (в течение 1 ч) инкубации реакционной смеси проводится полуколичественный визуальный учет результатов активности. При образовании в результате реакции гомогенной взвеси или хлопьев гиалуроновой кислоты диагностируют псориатический артрит, а при образовании компактного или рыхлого сгустка - анкилозирующий спондилит. Способ осуществляется следующим образом. Негепаринизированную человеческую кровь в количестве 2-3 мл инкубируют при температуре 4 С до образования сгустка. Затем центрифугируют 10-15 мин в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно забирают чистую сыворотку. 12703 1 2009.12.30 Метод определения основан на образовании сгустка риванола с гиалуроновой кислотой обратно пропорционально деполимеризации последней под действием гиалуронидазной активности различного происхождения. Гиалуроновую кислоту получают по методам, предложенным РНИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи 7. Для этого пупочные канатики новорожденных собирают в достаточном количестве. Пуповины разрезают и отмывают от крови дистиллированной водой. Извлекают сосуды. Взвешивают полученный материал. Далее препарат отмывают трехкратно большими объемами дистиллированной воды, обсушивают на фильтровальной бумаге и измельчают до кашицеобразного состояния. При повторном взвешивании его масса увеличивается приблизительно в два раза. Материал оставляют в течение ночи на холоде при 4 С. После этого препарат нагревают до кипения и фильтруют через ватный фильтр. Препарат гиалуроновой кислоты разливают по флаконам и замораживают до постановки реакции. Перед постановкой его размораживают и осветляют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин. Стандартизацию препарата осуществляют по оптической плотности риванолового сгустка. Для этого к 0,2 мл приготовленного препарата гиалуроновой кислоты добавляют 0,1 мл 0,15 М раствора хлорида натрия, тщательно встряхивают, далее вносят 0,1 мл рабочего 0,004 М ацетатного буфера рН 3,8, содержащего 0,15 М раствор хлорида натрия, и так же тщательно встряхивают. Определение проводят в центрифужной пробирке. Далее на поверхность смеси наслаивают 0,02 мл 0,75 раствора риванола и встряхивают до получения сгустка. После этого пробу отмывают 5-8 мл дистиллированной воды, осаждая сгусток в течение 2-3 мин при комнатной температуре. При необходимости сгусток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 мин, надосадок сливают. Сгусток экстрагируют 0,5 мл смеси равных объемов 1 н НС и концентрированной серной кислоты. Смесь готовят с соблюдением необходимых предосторожностей в термостойкой посуде в вытяжном шкафу в бане с водяным охлаждением при температуре 5-10 С. Приливают малыми порциями серную кислоту к 1 н НС с постоянным помешиванием, предупреждая нагревание. Для экстракции риванола после добавления смеси пробы прогревают при 100 С в течение 2-3 мин. После экстракции хромогена 0,2 мл пробы вносят в стандартный планшет для ИФА и фотометрируют на мультискане АИФ М/340 (методика 1, максимум поглощения светофильтра - 405 нм). Для работы используют гиалуроновую кислоту при оптической плотности сгустка 0,85-1,05 при фотометрии. При необходимости препарат разводят в соответствующее число раз дистиллированной водой. При использовании стандартного коммерческого препарата гиалуроновой кислоты препарат тщательно растворяют в дистиллированной воде и так же проверяют сгусток риванолом. Проведение реакции осуществляют следующим образом к 0,2 мл раствора стандартизованного препарата гиалуроновой кислоты добавляют 0,1 мл сыворотки, разведенной 1/100, 1/200 и 1/500 физиологическим раствором, тщательно встряхивают, далее вносят 0,1 мл рабочего 0,004 М рН 3,8 ацетатного буфера, содержащего 0,15 М раствор хлорида натрия, и так же тщательно встряхивают. В контроле вместо сыворотки используют 0,15 М раствор хлорида натрия. Постановку реакции осуществляют в центрифужных пробирках в дублях. После инкубации в течение 1 часа при 37 С на поверхность проб наслаивают 20 мкл 0,75 раствора риванола, встряхивают до получения сгустка. В случае высокой активности сгусток в первом разведении не образуется. Далее оценивают реакцию. При визуальном учете реакцию сгусткообразования оценивают в баллах. Отсутствие активности - компактный сгусток - 0 баллов 1 балл - минимальная активность - рыхлый сгусток 2 балла - слабая активность - рыхлый сгусток,хлопья, нити 3 - умеренная активность - хлопья, нити 4 - высокая активность - распад 3 12703 1 2009.12.30 сгустка, хлопья, нити 5 баллов - максимальная активность - полный распад сгустка ГК с образованием гомогенной взвеси. Нами обследовано 47 пациентов со спондилоартропатиями (29 больных с псориатическим артритом и 18 пациентов с анкилозирующим спондилитом). Контрольной группой послужили 39 здоровых лиц. Результаты определения уровней гиалуронидазной активности сывороток у больных представлены в таблице. Уровни гиалуронидазной активности сывороток крови у больных псориатическим артритом и анкилозирующим спондилитом (разведение сыворотки 1/100) Достоверность различий межГиалуронидазная активОбследованные лица ду группами пациентов и здоность сывороток, баллы ровыми лицами Пациенты с псориатическим 4,380,1829 р 0,001 артритом Пациенты с анкилозирующим 1,940,1718 р 0,05 спондилитом Здоровые лица 1,260,01639 При сравнении уровней сывороточной гиалуронидазной активности у пациентов оказалось, что данный вид активности у больных псориатическим артритом статистически достоверно превышает аналогичные показатели у больных анкилозирующим спондилитом (р 0,001) как по уровням активности, так и по частоте встречаемости. Из 29 пациентов с псориатическим артритом гиалуронидазную активность сыворотки 4 и более баллов,проявляющуюся образованием в ходе реакции гомогенной взвеси или хлопьев гиалуроновой кислоты, демонстрировали 25 больных (86 ), среди 18 пациентов с анкилозирующим спондилитом и здоровых лиц данный уровень активности не выявлялся. Если за диагностический уровень для псориатического артрита принять гиалуронидазную активность 4 и более баллов, характеризующуюся образованием в результате реакции гомогенной взвеси или хлопьев гиалуроновой кислоты, то диагностическая чувствительность метода равняется 86,2 , а диагностическая специфичность - 100 , отношение правдоподобия положительного результата теста (ОП) стремится к бесконечности (деление на ноль), а отношение правдоподобия отрицательного результата теста (ОП-) составляет 0,14. Согласно рекомендациям Американской коллегии ревматологов 8 наиболее полезными для диагностики ревматических заболеваний являются лабораторные тесты с ОП 5 и ОП- 0,2 полезными - с ОП 2 и 5, ОП-0,2 и 0,5 не имеющими пользы - с ОП 2 и ОП-0,5. Таким образом, определение гиалуронидазной активности сыворотки крови для дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита является наиболее полезным диагностическим тестом. Эффективность определения сывороточной гиалуронидазной активности для дифференциальной диагностики псориатического артрита и анкилозирующего спондилита определяется тем, что этот метод является простым и дешевым, не требует специальных навыков и оборудования, позволяет получить результат в течение 1,5-2 ч от взятия крови. Источники информации 1. , ,/ , //..- 2005.- . 62.- . 113-118. 2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний.- М., 2006.- С. 64-65.. .- 1996.- . 256.-2.- .165-173. 5...( ) / . . .1999.- . 58.- . 186-188. 6. Лефковитц А., Пернис Б. Методы исследования в иммунологии.-М. Мир, 1981.С. 230-239 (прототип). 7. Инструкция по применению гиалуронидазы стрептококковой сухой от 1 авг. 1986. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5