Устройство для электрической стимуляции стволовых клеток

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК(71) Заявители Белорусский государственный университет Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Молчанов Павел Геннадьевич Денисов Андрей Анатольевич Булай Павел Михайлович Питлик Тарас Николаевич Черенкевич Сергей Николаевич Кульчицкий Владимир Адамович Хотянович Маргарита Олеговна(73) Патентообладатели Белорусский государственный университет Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Устройство для электрической стимуляции биологических клеток в культуре, работающее со стандартными культуральными приспособлениями, включающее генератор электрических импульсов стимуляции, набор стимулирующих электродов, расположенных в крышке культуральной емкости и погруженных в рабочем состоянии в раствор, омывающий стимулируемую культуру, набор соединительных кабелей, обеспечивающий 89572013.02.28 передачу электрической энергии от генератора к стимулирующим электродам, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит микроконтроллер, генерирующий импульсы произвольной формы и амплитуды как периодические/квазипериодические, так и апериодические, основываясь на встроенном языке описания стимулирующих последовательностей, причем файл описания этих последовательностей хранится как во встроенной памяти микроконтроллера, так и в переносном модуле памяти дополнительные электронные схемы и/или компоненты для компенсации полного заряда, протекающего через стимулирующие электроды дополнительные измерительные электроды, соединенные с дополнительным регистрирующим блоком для измерения напряженности поля в растворе.(56) 1.-206/212/218/220 найдено 2011-12-20 Найдено в Интернет/// 2. Патент США 7148059, МПК 12 1/34, 2006. Полезная модель относится к устройствам, применяемым в области клеточных биотехнологий, воздействующим на биологические клетки, находящиеся в культуре ткани,электрическим полем путем пропускания электрического тока, т.е. стимуляции, через электроды, расположенные в культуральной емкости рядом с клетками. Известно устройство 1 для электрической стимуляции биологических клеток, работающее со стандартными культуральными планшетами, включающее генератор электрических импульсов стимуляции, набор стимулирующих электродов, расположенных на специальном держателе и погружаемых в рабочем состоянии в раствор, омывающий стимулируемую культуру, набор соединительных кабелей, обеспечивающий передачу электрической энергии от генератора к стимулирующим электродам. Стимулирующие последовательности, создаваемые данным устройством, представляют собой наборы биполярных импульсов тока прямоугольной формы, протекающие через стимулирующие электроды. Параметры импульсов, которые задает устройство, включают изменение амплитуды и длительности импульсов в последовательности, частоту импульсов в последовательности и длительность последовательности. Наиболее близким техническим решением к заявляемому является устройство 2 для долговременной электрической стимуляции биологических клеток в культуре, работающее со стандартными культуральными приспособлениями чашками Петри, планшетами или культуральными флаконами, включающее генератор электрических импульсов стимуляции,набор стимулирующих электродов, расположенных в крышке культуральной емкости и погруженных в рабочем состоянии в раствор, омывающий стимулируемую культуру, набор соединительных кабелей, обеспечивающий передачу электрической энергии от генератора к стимулирующим электродам. Стимулирующие последовательности, создаваемые данными устройствами, представляют собой наборы импульсов напряжения или тока прямоугольной формы, прилагаемые к стимулирующим электродам (для напряжения) либо протекающие через стимулирующие электроды (для тока). Импульсы в описываемых устройствах могут быть биполярными, иметь только положительную полярность, иметь только отрицательную полярность или состоять из чередующихся пачек импульсов положительной и отрицательной полярностей. Параметры импульсов, задаваемые устройством, включают изменение амплитуды и длительности импульсов в последовательности, количество импульсов в последовательности и длительность последовательности. Однако данные конструкции приборов обладают недостатками, связанными с фиксированной формой импульсов и малым набором варьируемых параметров, которые задаются внешними органами управления и не сохраняются в приборах. Это приводит к длительной перенастройке приборов при смене протоколов стимуляции. Кроме того, ука 2 89572013.02.28 занные приборы не обеспечивают точную компенсацию полного заряда, проходящего через стимулирующие электроды, в результате чего может происходить генерация активных химических соединений на поверхностях электродов, что, как правило, оказывает негативный эффект на культивируемые клетки. Также существенным недостатком приборов является отсутствие компонентов и/или схем для контроля напряженности поля в растворе, омывающем культивируемые клетки, что может приводить к дрейфу параметров стимуляции в ходе эксперимента и к общему разбросу значений стимуляции между различными экспериментами. Задачей полезной модели является создание устройства для электрической стимуляции стволовых клеток, обеспечивающего упрощение его использования, расширение диапазона варьируемых параметров, повышение точности стимуляции и увеличение времени его работы. Поставленная задача решается тем, что устройство для электрической стимуляции биологических клеток в культуре, работающее со стандартными культуральными приспособлениями, включающее генератор электрических импульсов стимуляции, набор стимулирующих электродов, расположенных в крышке культуральной емкости и погруженных в рабочем состоянии в раствор, омывающий стимулируемую культуру, набор соединительных кабелей, обеспечивающий передачу электрической энергии от генератора к стимулирующим электродам, дополнительно содержит микроконтроллер, генерирующий импульсы произвольной формы и амплитуды как периодические/квазипериодические, так и апериодические, основываясь на встроенном языке описания стимулирующих последовательностей, причем файл описания этих последовательностей хранится как во встроенной памяти микроконтроллера, так и в переносном модуле памяти дополнительные электронные схемы и/или компоненты для компенсации полного заряда, протекающего через стимулирующие электроды дополнительные измерительные электроды, соединенные с дополнительным регистрирующим блоком для измерения напряженности поля в растворе. Сущность полезной модели заключается в том, что заявляемое устройство электрической стимуляции содержит более совершенный модуль генератора, способный интерпретировать код протокола стимуляции, написанный на встроенном языке описания последовательностей стимуляции, и генерировать импульсы произвольной амплитуды и порядка следования как периодического/квазипериодического, так и апериодического,например импульсы, собранные в пачки с различными величинами амплитуды, длительности и количества в течение суток. Код протокола стимуляции может храниться как во внутренней памяти прибора, так и на внешнем носителе, что делает возможной быструю смену протокола эксперимента путем смены носителя кода стимуляции. В заявляемом устройстве электрической стимуляции присутствуют схемы компенсации полного заряда,протекающего через стимулирующие электроды, что позволяет уменьшить генерацию химически активных веществ на электродах прибора, а значит, снизить вредное воздействие на клетки и, как следствие, увеличить длительность эксперимента. Дополнительно устройство оснащается модулями измерения разности потенциалов и подключенными к ним измерительными электродами, что позволяет определять величину напряженности поля, возникающую в области нахождения клеток, сравнивать ее с заданным значением и производить корректировку в зависимости как от параметров стимулирующих электродов, так и от параметров культуральной среды. Сущность полезной модели поясняется фигурой, где изображено заявляемое устройство долговременной электрической стимуляции. Устройство состоит из генератора импульсов стимуляции 1, включающего в себя микроконтроллер 2, блока долговременной энергонезависимой памяти 3, блока формирования импульса с выравниванием заряда 9,блока измерения разности потенциалов 10, разъема соединения 5 с внешними модулями памяти 4, разъема соединения 7 с внешней управляющей системой 6, разъемов соедине 3 89572013.02.28 ния 11 с кабелями электродов регистрации и стимуляции 13. К устройству также относятся силовые и измерительные кабели 13, подключаемые к генератору посредством разъемов 12 и соединенные с электродами стимуляции 17 и с электродами измерения 18,которые, в свою очередь, встроены в крышку 14 культуральной емкости (чашки Петри) 15, содержащей питательную среду с культивируемыми клетками 16. Заявляемое устройство работает следующим образом. Оператор вводит в микроконтроллер 2 командный файл стимуляции при помощи внешнего модуля памяти 4 или через внешнюю управляющую систему 6. Если командный файл отсутствует или намеренно не вводится, то микроконтроллер может считывать файл из внутренней энергонезависимой памяти 3. В соответствии с командным файлом микроконтроллер формирует эпюры сигналов для каждого канала стимуляции и передает их на блоки формирования импульсов стимуляции 9. Посредством соединительных кабелей 13 и электродов стимуляции 17 электрический сигнал подается в культуральную емкость с биологическими клетками 16. Протекающий через раствор ток создает разность потенциалов на измерительных электродах 18, которая через кабели 13 регистрируется блоком измерения разности потенциалов 10. Микроконтроллер 2, сравнивая данные о возникшей разности потенциалов со значением, синтезированным в соответствии с командным файлом, может вносить корректировки в амплитуду импульсов стимуляции, подстраиваясь под характеристики стимулирующих электродов 17 и культуральной среды 16. Лабораторный образец заявляемого устройства использовался для длительной хронической стимуляции мезенхимальных стволовых клеток человека в культуре. Выделенные мезенхимальные стволовые клетки высевались в стандартные чашки Петри диаметром 35 мм. Блок стимулирующих электродов, расположенных на специальном держателе,опускался сверху в чашки таким образом, чтобы стимулируемые мезенхимальные стволовые клетки располагались между электродами. Далее блок стимулирующих электродов вместе с чашками Петри помещался в клеточный инкубатор, электроды подключались к генератору. Последовательности стимулирующих импульсов вводились в лабораторный образец устройства посредством внешней управляющей системы в виде протокола стимуляции. Протокол стимуляции обеспечивал генерацию импульсов длительностью 2 мс прямоугольной ассиметричной биполярной формы. Импульсы стимуляции были собраны в пачки (серии) из 1-4 штук. Частота следования пачек составляла 10 Гц. Амплитуда импульсов составляла 5-20 В/м. Стимуляция начиналась на вторые сутки культивирования и проводилась непрерывно в течение 4 суток. В результате длительного воздействия электрической стимуляции обнаружено увеличение степени арборизации клеток на 25-40 и увеличение степени экспрессии потенциал-зависимых натриевых каналов на 15-30(по сравнению с контролем), что свидетельствует об ускорении нейрогенной дифференцировки стволовых клеток. При этом отрицательные действия хронической электрической стимуляции на культивируемые клетки, связанные с воздействием химически активных веществ, не зафиксированы. Таким образом, заявляемая полезная модель обеспечивает расширение диапазона варьируемых параметров вследствие произвольного изменения формы и сочетания последовательности импульсов стимуляции быструю и простую смену протоколов стимуляции,обеспечивающую упрощение ее использования возросшее время стимуляции как результат подавления процессов электрохимической генерации химически активных веществ посредством компенсации полного заряда, протекающего через стимулирующие электроды возросшую точность генерации напряженности поля стимуляции благодаря наличию отдельных цепей измерения разности потенциалов. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4