Способ определения преобладающего механизма гибели клеток в клеточных популяциях

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕОБЛАДАЮЩЕГО МЕХАНИЗМА ГИБЕЛИ КЛЕТОК В КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр радиационной медицины и экологии человека(72) Авторы Горанов Виталий Анатольевич Мохорт Татьяна Вячеславовна Мельнов Сергей Борисович Горанова Юлия Анатольевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека(57) Способ определения преобладающего механизма гибели клеток в клеточных популяциях путем цитофлюориметрического определения распределения фракций ДНК, отличающийся тем, что осуществляют динамическое наблюдение за избирательным накоплением красителя компартментами клеток и при получении статистически достоверного различия преобладания количества клеток, утративших диплоидную ДНК-организацию, делают вывод об апоптозопосредованной гибели клеток, а при преобладании этидиумбромидпозитивных клеток - о некрозоопосредованной гибели клеток.(56). . .. - 1994. - . 42. - . 149-158. Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторная диагностика. Известен способ определения основных путей гибели клеток при патофизиологических процессах в клеточных популяциях путем цитофлюориметрического определения поглощения красителя компартментами клеток - в частности ДНК с последующей дифференциацией пути гибели по спектрам осциляции, заключающийся в том, что с помощью проточного цитофлюориметра определяется нарастание количества фрагментов ДНК в так называемой гиподиплоидной части спектра осциляции по пропидиуму иодату (этидиуму бромиду), по чем судят о количестве клеток, претерпевающих апоптоз 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является цитофлюориметрическое определение распределения фракций ДНК. Однако указанный способ обладает следующими недостатками. Недостаточной точностью дифференциации пути гибели клеток в период исследования в случае преобладания в популяции клеток, претерпевающих позднюю стадию апоптоза(программируемой клеточной гибели), когда происходит наложение цитофлюориметрических характеристик клеток, гибнущих как путем апоптоза, так и путем некроза. 6206 1 Этот же момент обусловливает и следующий недостаток прототипа - трудность верификации временной динамики развития апоптозной гибели клеток в культуре. Задача данного изобретения - повышение точности дифференциации путей гибели клеток в популяции. Поставленная задача достигается следующим образом предложен способ определения преобладающего механизма гибели клеток в клеточных популяциях путем цитофлюориметрического определения распределения фракций ДНК, отличающийся тем, что осуществляют динамическое наблюдение за избирательным накоплением красителя компартментами клеток и при получении статистически достоверного различия преобладания количества клеток, утративших диплоидную ДНК-организацию, делают вывод об апоптозопосредованной гибели клеток, а при преобладании этидиумбромидпозитивных клеток - о некрозоопосредованной гибели клеток. В основе данного способа лежат следующие механизмы, позволяющие реализовать его на практике увеличение проницаемости мембраны к этидиум бромиду, что свидетельствует о ее дестабилизации. сепарация ядра клетки, сопровождающегося утратой диплоидности ДНК. Так как при апоптозе фаза дезагрегации генетического материала (ДНК) в подавляющем большинстве случаев предшествует заметным изменениям структурно-функциональной целостности мембраны клетки, то динамическое преобладание первого показателя над вторым позволяет сделать заключение о том, что в данном образце отмечается некрозопосредованная гибель клеток. Динамическое преобладание второго показателя над первым позволяет сделать вывод о преобладании апоптозопосредованной гибели в данном образце. Способ осуществляют следующим образом необходимо провести исследование сепарации ядерно-мембранного повреждения в клеточных популяциях 2-х разных типов - суспензии свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и 6 дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных -клеток поджелудочной железы, первоначально полученных путем ферментативной обработки выделенного и измельченного в стерильных условиях материала поджелудочных желез эмбрионов крыс и затем культивированных при температуре 37 С в среде 1640 с 5 -ной фетальной телячьей инактивированной сывороткой и 40 мкг/мл гентамицина. При этом как безусловный стимул развития апоптоза в р-клетках поджелудочной железы используют интерлейкин-1 в концентрации 10 ЕД/мл при длительной экспозиции в течение 72 часов с перерывом после 18 часов экспозиции на 12 часов, а для лимфоцитов преднизолон в различных аликвотах (0,01 мкг/мл 0,1 мкг/мл 0,5 мкг/мл). В качестве позитивного контроля для воспроизведения некроза в экспериментальных популяциях клеток используют высокую температуру инкубация (43,3 С - 40 минут) для лимфоцитов и аллоксан в концентрации 2 мМ для -клеток. Разница между скоростью распада ядер и скоростью повреждения мембраны клеток характеризует то, какой механизм преимущественно лежит в основе гибели клеток - некроз или апоптоз. В случае преобладания апоптотической гибели клеток должно наблюдаться быстрое уменьшение количества ядер, содержащих ДНК в виде диплоидного набора (2 п), в то время как количество клеток,позитивных на повреждение мембраны и распад на фрагменты(в тестах с этидиумом бромидом) будет отставать от количества фрагментированной ДНК. В случае преобладания некроза будет наблюдаться обратная картина. Количество распавшихся ядер определяют с помощью цитофлюориметрав динамике культивирования (стандартная двухэтапная методика 2). Для получения необходимого количества клеток,(10 000) используют методику сортировки клеток, исследуемых в каждом экспериментальном образце (лунка 96-луночного планшета) на цитофлюориметре. Благодаря этому, к окончанию эксперимента потери клеточного составляют от 2,1 до 3,0 . 2 6206 1 Определение второго показателя этидиум-позитивных клеток (ЭПК) осуществляют основной по методике . . 1996 3, преимущественно включающей инстиляцию 0,01 этидиума бромида в среду культивирования клеток. Для окончательной верификации преобладающего механизма гибели исследуемых клеток осуществляют динамическое наблюдение за избирательным распределением красителя компартментами клеток по соотношению количеств распавшихся ядер и этидиумбромидпозитивных клеток. Для свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров при инкубации с преднизолоном в концентрации ОД мкг/мл оно равно на 0,5 часу инкубации 0,99 на 2 час инкубации - 2,1 на 6 часу инкубации - 1,7. Статистическая достоверность различия между исследуемыми показателями для каждого периода времени на 0,5 час инкубации р 0,1 на 2 час инкубации р 0,01 на 6 часу инкубации - р 0,01. Это свидетельствует об активно-протекающем апоптозе клеток в данной популяции на 2 час инкубации. Для свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров при инкубации при высокой температуре (43,3 С - 40 минут) оно равно на 0,5 часу инкубации 0,95 на 2 час инкубации - 0,78 на 6 часу инкубации - 1,08. Статистическая достоверность различия между исследуемыми показателями для каждого периода времени на 0,5 час инкубации р 0,1 на 2 час инкубации р 0,01 на 6 часу инкубации - р 0,1. Это свидетельствует об активно-протекающем некрозе клеток в данной популяции на 2 часу инкубации. Для 6-дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных -клеток поджелудочной железы при инкубации с интерлейкином-1 в концентрации 10 ЕД/мл (при длительной экспозиции в течение 72 часов с перерывом после 18 часов экспозиции на 12 часов) оно отражено на таблице. Полученные результаты свидетельствуют об активно-протекающем апоптозе клеток в данной популяции с 1 по 6 час инкубации и на 66 час инкубации. Для 6-дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных -клеток поджелудочной железы при инкубации с аллоксаном в концентрации 2 мМ в течение 18 часов исследуемое соотношение колеблется в пределах 0,3-0,86 (р 0,05) на протяжении всего периода инкубации. Это свидетельствует об активно-протекающем некрозе клеток в данной популяции на протяжении всей инкубации. Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими преимуществами 1. Возможность четкой дифференцировки преобладание той или иной клеточной гибели (апоптоза/некроза) во временной динамике. 2. Возможность проведения скрининга значительного количества экспериментального материала при экономии средств для тонкой идентификации каждого из процессов. 3. Простота выполнения заявляемого способа. 6206 1 Таблица 1 Соотношение количества распавшихся ядер и этидиум-бромидпозитивных клеток при инкубации культуры -клеток с интерлейкином-1 Время экспозиции Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.