Способ исследования структуры биологических микрообъектов, преимущественно клеток крови

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ, ПРЕИМУЩЕСТВЕННО КЛЕТОК КРОВИ(71) Заявитель Лапотко Дмитрий Олегович(72) Автор Лапотко Дмитрий Олегович(73) Патентообладатель Лапотко Дмитрий Олегович(57) Способ исследования структуры биологических микрообъектов, преимущественно клеток крови, включающий световую микроскопию, при которой осуществляют лазерное воздействие на исследуемый объект и получают его термооптическое изображение, по которому судят о структуре исследуемого объекта, отличающийся тем, что получают два термооптических изображения, по первому из которых судят о поглощающей способности вещества структурных элементов исследуемого объекта, а по второму - об их размерах, для чего на исследуемый объект воздействуют первым пробным лазерным импульсом с длиной волны и 5832 1 энергией, слабо воздействующими на него, в результате чего формируют первое изображение объекта, после воздействия первым пробным лазерным импульсом на исследуемый объект воздействуют лазерным импульсом накачки, длина волны которого соответствует области поглощения вещества структурных элементов объекта, а энергия ниже порога его повреждения, для создания тепловой неоднородности, после чего с задержкой 110 нс относительно начала лазерного импульса накачки исследуемый объект подвергают воздействию вторым пробным лазерным импульсом с параметрами, идентичными первому, в результате чего формируют второе изображение объекта для получения первого термооптического изображения путем вычитания сигналов для соответствующих точек второго и первого изображений, и с задержкой 0,01 1 мкс относительно начала лазерного импульса накачки исследуемый объект подвергают воздействию третьим пробным лазерным импульсом, в результате чего формируют третье изображение объекта для получения второго термооптического изображения путем вычитания сигналов для соответствующих точек третьего и второго изображений.(56) Лапотко Д.О. и др. Квантовая электроника, 1999, т. 29,3. - С. 222-223. Изобретение относится к оптическим способам исследования структуры микрообъектов, в частности к исследованию структурного и функционального состояния клеток крови, и может найти применение в медицине и биологии. Известен способ определения жизнеспособности, применяемый в диагностических целях 1, при котором в суспензии клеток в солевом растворе возбуждают флюоресценцию с последующей количественной оценкой живых и мертвых клеток по гистограмме распределения интенсивности флюоресценции. Известен также способ по 2, при котором из крови выделяют чистую популяцию лейкоцитов и инкубируют ее раствором натрия хлорида, а учет реакции ведут по количеству неразрушенных клеток. Известен также способ для микроскопического измерения диаметра клеток в окрашенном мазке крови с помощью окуляр микрометра, источника излучения и регистрирующего элемента. При этом определяют цену одного деления шкалы окуляр микрометра для определенного микроскопа, с помощью которого производят эритроцитометрию. После чего измеряют диаметр не менее ста эритроцитов и, зная цену одного деления и количество эритроцитов с одинаковым числом делений, выражают результат в процентах и при необходимости строят эритрометрическую кривую 3. Однако процессы эти достаточно длительны и трудоемки, кроме того, невозможно исследовать живые клетки. Наиболее близким техническим решением (прототип) является способ исследования состояния клеток крови методом термооптической цитометрии, при котором осуществляют регистрацию термооптического отклика отдельной клетки с достаточным пространственным и временным разряжением, а с помощью лазерного калориметрического анализатора клеток осуществляют управление генерацией лазеров и регистрацию изображений 4. Задачей изобретения является создание эффективного процесса с возможностью работы с живыми отдельными клетками, естественные компоненты которых обладают слабым поглощением, за счет повышения чувствительности и пространственного разрешения исследований. Задача в способе исследования структуры биологических микрообъектов, преимущественно клеток крови, включающем световую микроскопию, при которой осуществляют лазерное воздействие на исследуемый объект и получают его термооптическое изображение, по которому судят о структуре исследуемого объекта, решена следующим образом. Получают два термооптических изображения, по первому из которых судят о поглощающей способности вещества структурных элементов исследуемого объекта, а по второму об их размерах, для чего на исследуемый объект воздействуют первым пробным лазерным 2 5832 1 импульсом с длиной волны и энергией, слабо воздействующими на него, в результате чего формируют первое изображение объекта, после воздействия первым пробным лазерным импульсом на исследуемый объект воздействуют лазерным импульсом накачки, длина волны которого соответствует области поглощения вещества структурных элементов объекта, а энергия ниже порога его повреждения, для создания тепловой неоднородности, после чего с задержкой 1-10 нс относительно начала лазерного импульса накачки исследуемый объект подвергают воздействию вторым пробным лазерным импульсом с параметрами, идентичными первому, в результате чего формируют второе изображение объекта для получения первого термооптического изображения путем вычитания сигналов для соответствующих точек второго и первого изображений, и с задержкой 0,01-1 мкс относительно начала лазерного импульса накачки исследуемый объект подвергают воздействию третьим пробным лазерным импульсом, в результате чего формируют третье изображение объекта для получения второго термооптического изображения путем вычитания сигналов для соответствующих точек третьего и второго изображений. При этом клетка исследуется в ее естественном состоянии, а использование стандартного оборудования существенно упрощает и значительно ускоряет процесс исследования. На чертеже фиг. 1 представлена схема осуществления предлагаемого способа. Способ осуществляется с применением стандартного оборудования, включающего микроскоп, импульсный пробный лазер и импульсный лазер накачки, а также регистрирующий элемент. Исследуемый объект, например, клетку крови, помещают в поле зрения микроскопа и подвергают облучению импульсом пробного лазерного излучения с длиной волны, например, 650 нм и энергией импульса, например, 10 ндж, слабо воздействующими на клетку. В результате формируется изображение клетки в исходном невозбужденном состоянии. Объект в этом случае находится в центре пробного лазерного пучка, перетяжка которого должна находится до плоскости исследуемого объекта (режим фазового контраста). Далее исследуемую клетку облучают импульсом лазерного излучения накачки, длина волны которого (532 нм) соответствует области поглощения вещества элементов клетки, а энергия - ниже порога ее повреждения (50 мкдж). При поглощении энергии импульса излучения лазера накачки возникает тепловая неоднородность в поперечной плоскости клетки, что приводит к изменению распределения показателя преломления вещества исследуемой клетки в этой же плоскости. Через определенный промежуток времени (задержка - 1-10 нс.), за который тепловая неоднородность существенно не изменяется, исследуемую клетку облучают вторым импульсом пробного лазерного излучения с идентичными первому параметрами, в результате чего формируют изображение (И 2) клетки, сохраняющей результат поглощения энергии импульса лазера накачки на начальной стадии. Режим фазового контраста обеспечивает преобразование распределения поля изменения фазы излучения пробного пучка объектом в поле распределения интенсивности излучения в плоскости регистрирующего элемента. Произведя вычитание сигналов для соответствующих точек второго и первого изображений, мы получаем (ТО 1 И 2-И 1) первое термооптическое изображение, характеризующее распределение тепловой неоднородности, индуцированной импульсом накачки, что соответствует изменению распределения показателя преломления в плоскости исследуемого объекта. Это термооптическое изображение характеризует распределение поглотительной способности вещества клетки на длине волны излучения лазера накачки. Изменяя длину волны излучения лазера накачки, можно получать спектр распределения. Произведя облучение третьим пробным импульсом с задержкой (10 нс - 1 мкс), получают изображение исследуемого объекта в пробном пучке на определенной стадии тепловой релаксации (остывание), скорость которого определяется размерами структуры, в которой произошло первоначальное тепловыделение. Производя вычитание сигналов для соответствующих точек третьего и второго изображений, получают второе термооптическое изображение (ТО 2 И 3-И 2). 3 5832 1 Измеряя величину относительного изменения амплитуды сигнала в разных точках изображения, можно определить размер структурного элемента, который является источником сигнала изображений И 1 и И 2, поскольку скорость остывания обратно пропорциональна квадрату размеров структуры. Определив скорость остывания по изменению амплитуды сигнала за время второй задержки в отдельно взятой точке второго термического изображения(ТО 2), можно рассчитать размер структуры, которая является источником сигнала. Описанный способ позволяет анализировать структуры, размер которых существенно меньше разрешающей способности оптического микроскопа, а именно определить их физические свойства (поглощение) по первому термооптическому изображению (ТО 1) и размеры - по второму термооптическому изображению (ТО 2). Анализируя термооптические изображения, полученные таким образом, можно судить о внутренней структуре объекта, которая плохо регистрируется в режиме фазового контраста при некогерентном источнике непрерывного излучения в силу ограничений по чувствительности и разрешающей способности. Предлагаемый способ позволяет как анализировать состояние единичной клетки, так и осуществлять статистический анализ при популяционных исследованиях. Он обеспечивает регистрацию (визуализацию) и измерение параметров слабо поглощающих и малоконтрастных клеток и клеточных структур, позволяет исследовать живые клетки, обеспечивает быстрый и точный анализ с использованием стандартного оборудования. Источники информации 1. А.с. СССР 1596247, МПК 0227/48, 1990. 2. А.с. СССР 1675768, МПК 01 33/49, 1991. 3. В.В. Меньшиков. Лабораторные методы исследования в клинике Справочник. - М. Медицина, 1987. - С. 114. 4. Д.О. Лапотко и др. Исследование влияния фотодинамического эффекта на микроорганизмы методом лазерной термооптической цитометрии//Квантовая электроника, 29, 3, декабрь 1999. - С. 222-223 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4