Способ идентификации Staphylococcus aureus

12 1/20 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное высшее учебное заведение Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Генералов Игорь Иванович Генералова Анжелика Геннадьевна Занько Сергей Николаевич(73) Патентообладатель Государственное высшее учебное заведение Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ идентификации, включающий посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования, определение каталазы, плазмокоагулазы и лецитиназы, отличающийся тем, что дополнительно проводят определение термонуклеазы при рН 8,0-9,0 и температуре 37 по методу предупреждения образования риванолового сгустка, и при наличии положительного теста на плазмокоагулазу или лецитиназу и положительного теста на термонуклеазу относят выделенный стафилококк к виду.(56) Приказ МЗ СССР 535. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений. Москва, 1985, с. 45-56.1611933 1, 1990.1258828 1, 1986.1442542 1, 1988.1648977 1, 1991. Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано для идентификации золотистого стафилококка. В настоящее время в клинико-бактериологических лабораториях среднего звена идентификацию и дифференциацию стафилококков обычно проводят согласно указаниям 535 приказа МЗ СССР от 22.04.85 г. 3. Данный способ включает следующие методы идентификации . посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования, определение каталазы, плазмокоагулазы, лецитиназы, ДНКазы, разложение маннита в анаэробных условиях. Все это требует значительного расхода реагентов, время выдачи окончательного ответа растягивается на 4-5 дней. 5289 1 Многие исследователи пытались упростить схему идентификации стафилококков 1. Тем не менее очевидно, что не существует единственного фенотипического критерия, по которому можно было бы высокодостоверно идентифицировать золотистый стафилококк. Для близкой к полной идентификации авторами предлагаются различные сочетания факторов (не менее 2-х) - нуклеаза и плазмокоагулаза, нуклеаза и лецитиназа, плазмокоагулаза и протеин А, плазмокоагулаза и разложение маннита в анаэробных условиях и т.д. Эти комбинации имеют приблизительно равные диагностические возможности, не достигающие, однако, 1001. В свою очередь, в бактериологических лабораториях крупных лечебно-профилактических учреждений все шире применяют системы автоматизированной идентификации возбудителей (например АТВ-32 или). Последние тесты базируются на разложении многочисленных углеводов 4. К сожалению, данная идентификация требует больших материальных затрат, учитывая стоимость аппаратуры и расходуемых материалов (от 10 до 100 тыс. ). Кроме того, и в этих методах вероятность идентификации. колеблется в пределах 95-97 . Прототипом нашего способа является унифицированный метод идентификации золотистого стафилококка по способу, изложенному в 535 приказе МЗ СССР от 22.04.85 3. Он включает 1) посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования,2) определение плазмокоагулазы,3) лецитиназы,4) ДНКазы (как дополнительный тест),5) разложение маннита в анаэробных условиях. Предлагаемый нами новый способ идентификации . повышает достоверность определения золотистого стафилококка и ускоряет идентификацию культур данного возбудителя. Это достигается при помощи новой комбинации тестов идентификации золотистого стафилококка с включением разработанного нами метода определения термонуклеазной активности стафилококков. Сущность предложения заключается в посеве исследуемого материала на желточносолевой агар с последующей микроскопией и определением каталазы, термонуклеазы,плазмокоагулазы и лецитиназы возбудителя в течение последующего дня исследования. Определение термонуклеазы возбудителя достигается обнаруженной нами способностью 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактата (риванола) образовывать сгусток с дезоксирибонуклеиновой кислотой обратно пропорционально ее деполимеризации под действием стафилококковой нуклеазы. Примеры осуществления способа. А. Общие положения. Нами было изучено 168 штаммов золотистого и эпидермального стафилококка, исследованного в качестве штамма сравнения. Штаммы были получены из Витебского городского центра гигиены, эпидемиологии и санитарии и идентифицированы согласно Приказу 535. Из 168 изученных культур 83 штамма принадлежали золотистому стафилококку(49,4 ), 85 штаммов - эпидермальному стафилококку (50,6 ). Штаммы золотистого стафилококка были в дальнейшем идентифицированы по предлагаемой нами методике. Б. Этапы идентификации Посев исследуемого материала на желточно-солевой агар, последущая микроскопия,определение каталазы, плазмокоагулазы и лецитиназы возбудителя проводят согласно приказу 535. Определение термонуклеазы осуществляют по разработанному нами способу. С этой целью для приготовления суспензии микробов берут несколько колоний стафилококка и 2 5289 1 суспендируют в дистиллированной воде. К 0,2 мл приготовленной взвеси микроорганизмов добавляют 0,1 мл раствора ДНК (500-700 мкг/мл). Далее в смесь прибавляют 0,1 мл 0,02 М трис- буфера, рН 8,4-8,6, содержащего 0,005 раствор хлорида кальция и 0,001 М раствор хлорида магния. Смесь инкубируют в термостат при 37 в течение 4 ч. Затем на поверхность проб наслаивают 20 мкл 0,5 раствора риванола и встряхивают для получения сгустка. Контролем служит проба, содержащая вместо суспензии микробов 0,2 мл дистиллированной воды. Полученные результаты по определению термонуклеазной активности оценивают в баллах 0 - отсутствие активности - крупный, компактный сгусток 1 - слабая активность - мелкий, рыхлый сгусток 2 - высокая активность - хлопья, нити 3 очень высокая активность - полный распад сгустка с образованием гомогенной взвеси. С учетом роста на желточно-солевом агаре, результатов микроскопии и каталазного теста критерием отнесения стафилококка к виду . является наличие не менее двух положительных основных тестов из 3 (плазмокоагулаза, ТНКаза и лецитиназа), причем 1 из двух первых тестов должен быть обязательно положительным. Эффективность способа. Наш способ идентификации золотистого стафилококка обладает следующие преимуществами по сравнению с прототипом. В унифицированном методе идентификации . тест на определение нуклеазы стафилококка предлагается лишь в качестве дополнительного. Это связано с тем, что в стандартном унифицированном способе используется метод выявления нуклеазы по Джеффрису 2, который определяет общую (а не термостабильную) нуклеазу стафилококка. В свою очередь, многочисленными исследованиями показано, что коагулазонегативные стафилококки также продуцируют ДНКазу (частота колеблется от 0-47,3 до 90100 ), хотя они проявляют ее в меньшей степени, приблизительно в 10 раз слабее, чем. 1. Продукции термостабильной ДНКазы у них не зарегистрировано. Отсюда в приказе 535 рекомендуется в качестве основного теста при идентификации золотистого стафилококка использовать тест на анаэробную ферментацию маннита (при противоположных или сомнительных результатах определения плазмокоагулазы и лецитиназы). Этот тест занимает 4-5 суток и значительно удлиняет исследование. Наш способ позволяет завершить полную идентификацию . в 2-3 дня, причем он оценивает именно термостабильную ДНКазу золотистого стафилококка как наиболее диагностически значимый критерий. Кроме того, использование нашего метода позволяет увеличить достоверность определения золотистого стафилококка, в частности - при его дифференциации с эпидермальным стафилококком. При использовании многомерных статистических методов (дисперсионного и дискриминантного анализа) было выявлено, что суммарная сила влияния используемых организованных факторов (термонуклеаза, плазмокоагулаза и лецитиназа) на определение вида стафилококка составляет 95 . Сила влияния межфакторного взаимодействия - 4,8 . В результате сумма влияния организованных факторов оказалась 99,8 . Поскольку полученный процент объясненной дисперсии стремится к 100 , то можно сказать, что в данной модели определение ТНКазы, плазмокоагулазы и лецитиназы дифференцирует виды стафилококков с высшей степенью достоверности. Данные показатели превышают описанные ранее в литературе 1. Дискриминантный анализ подтвердил закономерности, полученные при проведении регрессионного и дисперсионного анализа. При его осуществлении была выделена лишь одна дискриминантная функция, причем величина объясненной дисперсии составила 100 , коэффициент канонической корреляции 0,97561 при р 0,0001. Таким образом, использование нашего метода позволяет сократить время определения. с 5-7 дней до 2-3 суток, а также повысить достоверность его идентификации. 5289 1 Источники информации 1. Акатов А.К., Зуева А.С. Стафилококки. - М., 1983. 2. Никитин В.М. Справочник экспресс-методов биохимической индикации микробов. Кишинев, 1986. - С. 146-154. 3. Приказ 535 от 22 апреля 1985. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. - М., 1985. 4.- -32. - , 1995. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.