Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Михаленко Елена Петровна Чакова Наталья Николаевна Чеботарева Наталья Вячеславовна Крупнова Эвелина Вячеславовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56)7581 1, 2005. ЧАКОВА Н.Н. Цитогенетические критерии прогнозирования радиочувствительности соматических клеток больных плоскоклеточным раком легкого Автореф. дис. - Минск, 2004. - . 6-9.06340699 , 1994.(57) Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого, отличающийся тем, что с послеоперационной ткани легкого готовят мазок-отпечаток и, если в мазке содержание клеток с микроядрами составляет - более 0,3 , апоптозных - более 3,3 и многоядерных более 2,9 , диагностируют немелкоклеточный рак легкого. 12145 1 2009.08.30 Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, предназначено для повышения достоверности диагностики рака легкого. Аналогом данного способа исследования является цитологический анализ мазковотпечатков, полученных во время операционного вмешательства или при проведении биопсии, который является одним из основных методов диагностики рака легкого 1, 2. Однако необходимо учитывать возможности и пределы цитологического метода. Его эффективность, т.е. количество выявленных злокачественных опухолей, колеблется от 45 до 90 . Недостатком цитологического способа является то, что он эффективен только при попадании опухолевых клеток в препарат. Информативность мазков, получаемых при тонкоигольной аспирационной биопсии, зависит от ряда факторов размеров новообразования, его расположения, опыта берущего биопсию. Скудные клеточные пунктаты,как правило, малоинформативны, и их интерпретация затруднена. Цитологическая диагностика злокачественных опухолей имеет также существенный недостаток, заключающийся в субъективности визуального анализа цитологического материала, во многом зависящего от опыта цитолога. Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и злокачественных поражений легких Евгущенко Г.В. и др., выбранное в качестве прототипа 3. Известное решение содержит способ диагностики злокачественных поражений легких путем исследования клеток бронхиального эпителия, полученных путем браш-биопсии. Согласно изобретению, в клетках бронхиального эпителия производится количественный подсчет клеток с ядерными протрузиями. Недостатками прототипа являются проведение диагностики злокачественных поражений легких только по одному параметру (частота клеток с ядерными протрузиями) длительность и сложность приготовления цитогенетических препаратов. Технической задачей настоящего изобретения является сокращение длительности приготовления препаратов, повышение информативности цитогенетического анализа. Данный способ позволяет осуществлять диагностику немелкоклеточного рака легкого вне зависимости от попадания опухолевых клеток в исследуемый препарат. Предлагаемый нами способ основан на комплексном подходе, включающем цитогенетический анализ ткани легкого одновременно по всем перечисленным параметрам, а именно по частоте клеток с микроядрами, а также по уровням апоптозных и многоядерных клеток. Выявленные нами уровни предложенных показателей отражают различные этапы канцерогенеза и могут являться дополнительными критериями для повышения достоверности цитологической диагностики немелкоклеточного рака легкого. Развитие злокачественной опухоли - это многофакторный и многостадийный процесс,в основе которого лежит накопление клетками различных генетических изменений, приводящих к злокачественной трансформации. Малигнизация нормальных клеток является следствием каскадного накопления в геноме клеток различных нарушений, проявляющихся и на цитогенетическом уровне. Известно, что у онкологических больных наблюдается повышенная частота клеток с микроядрами, представляющими собой отставшие в процессе митоза фрагменты хромосом. Наличие микроядер в клетках свидетельствует об индукции генных или хромосомных мутаций 4. Другим важным показателем, характеризующим процесс канцерогенеза, является повышенный уровень клеток, гибнущих путем апоптоза 5. При опухолеобразовании наблюдается также увеличение количества многоядерных клеток, которые являются индикатором пролиферативной активности. Образование мно 2 12145 1 2009.08.30 гоядерных клеток происходит в результате деления ядра без деления цитоплазмы, а также может быть следствием аномалий митоза при действии патологических факторов 6. Сущность способа заключается в подсчете количества клеток с микроядрами, апоптозных и многоядерных клеток на мазках-отпечатках ткани легкого. Клетки с микроядрами показаны на фиг. 1. Апоптозные и многоядерные клетки показаны на фиг. 2 и 3 соответственно. Способ осуществляется следующим образом. После забора биопсийного или операционного материала легкого приготавливают мазок-отпечаток, высушивают его на воздухе,фиксируют в течение 2-3 мин смесью метанола с добавлением небольшого количества(501) красителя Май-Грюнвальд. Сразу после фиксации производят окраску по рутинной методике красителем Гимза 5, разведенным 129 дистиллированной водой в течение 10-20 мин. Стекла ополаскивают чистой водой, сушат при комнатной температуре и затем анализируют. С помощью светового микроскопа определяют частоту анализируемых показателей в выборках не менее чем из 500 клеток. На основании проведенных цитогенетических исследований установлено, что в опухолевой и неопухолевой тканях легкого больных немелкоклеточным раком легкого встречаются цитогенетические изменения, статистически достоверно превышающие эти показатели в контрольной группе. В контрольной группе средний уровень клеток с микроядрами составил 0,190,01 , уровень апоптозных клеток - 2,290,04 и уровень многоядерных клеток - 2,580,35 . У 84 обследованных пациентов в опухолевой ткани и у 57 в неопухолевой ткани уровень клеток с микроядрами был выше 0,30(средние уровни 0,710,07 и 0,420,03 соответственно). Средние уровни апоптозных клеток составили 4,250,48 в опухолевой ткани и 3,280,28 в неопухолевой ткани больных немелкоклеточным раком. При этом у 53 пациентов в опухолевой ткани и у 45 в неопухолевой ткани уровень апоптозных клеток был выше 3,30 . Уровень многоядерных клеток у 81 обследуемых пациентов в опухолевой ткани и у 84 в неопухолевой ткани превышал значение 2,90(средние уровни 5,800,69 и 6,200,80 соответственно). Таким образом, при значениях исследуемых параметров уровень клеток с микроядрами более 0,30 , апоптозных более 3,30 и многоядерных более 2,90 , судят о наличии злокачественного новообразования легкого. Способ подтверждается приведенными ниже примерами. Пример 1. Б-ная П. Уровень МЯ в мазке-отпечатке неопухолевой ткани легкого 0,59 , уровень апоптозных клеток 3,86 , уровень многоядерных клеток 11,29 . Послеоперационный гистологический диагноз - немелкоклеточный рак легкого. Пример 2. Б-ная Ш. Уровень МЯ в мазке-отпечатке неопухолевой ткани легкого 0,56 , уровень апоптозных клеток 3,81 , уровень многоядерных клеток 4,42 . Послеоперационный гистологический диагноз - немелкоклеточный рак легкого. Пример 3. Б-ная З. Уровень МЯ в мазке-отпечатке неопухолевой ткани легкого 0,32 , уровень апоптозных клеток 3,30 , уровень многоядерных клеток 3,40 . Послеоперационный гистологический диагноз - немелкоклеточный рак легкого. Пример 4. Б-ной . Уровень МЯ в мазке-отпечатке неопухолевой ткани легкого 0,30 , уровень апоптозных клеток 5,63 , уровень многоядерных клеток 5,52 . Послеоперационный гистологический диагноз - немелкоклеточный рак легкого. Предложенный нами способ цитогенетической диагностики немелкоклеточного рака легкого позволяет увеличить точность и эффективность цитологической диагностики, не требует дополнительного лабораторного оборудования и реактивов, высокой квалификации медперсонала. 3 12145 1 2009.08.30 Источники информации 1. Руководство по цитологической диагностике опухолей человека / Под ред. Петровой А.С.и Птоховой М.П., 1976. - 304 с. 2. Петрова А.С., Полонская Н.Ю. Клиническая цитология и ее возможности в ранней диагностике опухолей и пути совершенствования метода // Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. -1. - С. 25-28. 3. Патент РФ 2 272 290, МПК 01 33.48, 2006. 4..,,.// - 1999. - . 425.1. - . 1 -8. 5..,.// . - 1998. . 281. - . 1305-1308. 6. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Ольнев М.Г. и др. Хромосомные мосты и хвостатые ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика. - 1998. - Т. 34. -1. - С. 61-64. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4