Способ оценки фототоксичности фотосенсибилизатора

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ФОТОТОКСИЧНОСТИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Козел Николай Владимирович Шалыго Николай Владимирович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ оценки фототоксичности фотосенсибилизатора, отличающийся тем, что инкубируют клетки водорослив среде Крамера-Майерса, в которую внесен фотосенсибилизатор, в присутствии кислорода при интенсивности света 140180 мкмоль квантовм-2 с-1 и судят о высокой фототоксичности фотосенсибилизатора, если после 15-30 минут инкубации наблюдают потерю подвижности клеток водоросли и изменение их формы до округлой или лизис клеток, или о низкой фототоксичности, если после 8 часов инкубации наблюдают незначительное изменение подвижности клеток водоросли и их формы. Изобретение относится к физиологии растений, а также медицине, в частности, к способам оценки фототоксичности сенсибилизаторов фотодинамического действия (фотосенсибилизаторов) и может быть использовано для скрининга фотосенсибилизаторов при разработке фотодинамических гербицидов и лекарственных препаратов для терапии онкологических заболеваний. Известен ряд биохимических методов, позволяющих определить степень токсичного воздействия ксенобиотиков, в том числе и фотосенсибилизаторов, на клетки растительного 1, 2 и животного 3 организмов. Недостатком биохимических методов анализа токсичного действия фотосенсибилизаторов является длительная многоступенчатая подготовка исследуемого препарата, применение дорогостоящего оборудования, такого как высокочувствительные спектрофлуо 15504 1 2012.02.28 риметры и спектрофотометры, центрифуги. Применение данных методов предполагает высокую квалификацию исследовательского персонала. Известно, что основными мишенями повреждающего действия фотосенсибилизаторов являются клеточные мембраны, в частности компоненты клеточных мембран - липиды 4. В связи с этим широко распространенным является способ оценки токсичного действия фотосенсибилизаторов на клетки растительных и животных организмов по образованию продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида. Этот способ является наиболее близким к предлагаемому. Для определения малонового диальдегида используют тест с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Образцы исследуемого материала предварительно инкубируют с фотосенсибилизатором или каким-нибудь другим способом добиваются определенного содержания фотосенсибилизатора в исследуемом материале, освещают его. После чего исследуемый препарат гомогенизируют с 0,25 -ной 2-ТБК, растворенной в 10 -ной трихлоруксусной кислоте, затем гомогенат инкубируют 30 мин в кипящей водяной бане, доводят объем до первоначального уровня дистиллированной водой и центрифугируют 15 мин при 8000 . Супернатант спектрофотометрируют при 530 нм. Количество ТБК-продуктов определяют используя коэффициент молярной экстинкции 1,55105-1 см-1 5. Недостатком данного способа является длительность проведения процесса, специфичность по отношению к разным объектам исследования, необходимость наличия дорогостоящего оборудования спектрофотометр, центрифуга, гомогенизатор. Задачей изобретения является разработка простого и экспрессного способа оценки фототоксичности сенсибилизатора. Результат достигается тем, что в способе оценки фототоксичности фотосенсибилизатора инкубируют клетки водорослив среде Крамера-Майерса, в которую внесен фотосенсибилизатор и присутствует кислорода. Затем пробу освещают с интенсивностью света 140-180 мкмоль квантов м-2 с-1. О высокой фототоксичности фотосенсибилизатора судят, если после 15-30 минут инкубации наблюдают потерю подвижности клеток водоросли и изменение их формы до округлой или лизис клеток. А о низкой фототоксичности судят, если после 8 часов инкубации наблюдают незначительное изменение подвижности клеток водоросли и их формы. Для оценки фототоксичности фотосенсибилизатора использовали в качестве тестобъекта одноклеточную подвижную водоросль, культивируемую на среде Крамера-Майерса 6. Отличительными признакамиявляется веретеновидная форма и высокая подвижность, определяемая вращением длинного жгутика. Длина клетки составляет от 30 до 200 мкм, что в десятки раз превышает диаметр таких распространенных в наших климатических условиях одноклеточных водорослей, как,,. Такие большие размеры клетокпозволяют без затруднений наблюдать за ними и проводить их подсчет с помощью светового микроскопа. Сущность изобретения заключается в том, что при внесении токсичного вещества в среду инкубации одноклеточная подвижная водоросльутрачивает подвижность и меняет форму, что можно визуально наблюдать в световой микроскоп. На фиг. 1 представлена водоросль. На фиг. 2 представлены клетки, инкубированные 30 мин на свету на среде, содержащей 10 мкМ бенгальского розового без кислорода (А) и с кислородом (Б). Способ осуществляют следующим образом. Берут клетки водорослив среде Крамера-Майерса и инкубируют. Фотосенсибилизатор вносят в инкубационную среду водоросли таким образом, чтобы его конечная концентрация во всех опытных сосудах с суспензией водоросли была одинаковой. В часть сосудов с суспензией водоросли фотосенсибилизатор не вносят и они явля 2 15504 1 2012.02.28 ются контролем. Затем все сосуды освещают в течение 0,25-8 часов при интенсивности 140-180 мкмоль квантов м-2 с-1. Фототоксичный эффект оценивают по изменению подвижности и формы клетокна свету. Поскольку фототоксичный эффект сенсибилизаторов связывают с генерацией ими на свету реакционно-активной формы кислорода - 12, а также с образованием радикала биомолекулы (который впоследствии окисляется кислородом), то для подтверждения фотодинамической природы повреждающего действия этих красителей в качестве дополнительного контроля используют суспензии водорослей, лишенные кислорода, так как помимо света необходимым фактором развития фотодинамических процессов является наличие в среде молекулярного кислорода 4. Для удаления кислорода из среды инкубации водоросли, суспензию помещают в склянки Дрекселя, продувают азотом и герметично закрывают. Примеры выполнения способа. В качестве примеров определяли токсичность фотосенсибилизаторов эозина, флуоресцеина и бенгальского розового (БР). Вещества вносили в инкубационную среду водоросли так, что их конечная концентрация составила 10 мкМ. Подсчет клеток проводили,используя камеру Горяева. Пример 1 При добавлении эозина в среду инкубации водоросли уже через 16 часов наблюдали гибель клеток на свету в сосудах без кислорода. На свету в сосудах с кислородом цитотоксичное действие эозина проявлялось в потере подвижности клеток через 0,5 час освещения. Таким образом установлено, что эозин способен вызывать сильные деструктивные процессы фотодинамической природы. Это вещество обладает высокой фототоксичностью. Пример 2 При добавлении флуоресцеина в среду инкубации водорослей на свету независимо от наличия кислорода подвижность и форма клеток в течение длительного промежутка времени до 8 час - изменялись незначительно, что указывает на его низкую фототоксичность. Пример 3 БР оказывал токсичное действие на клеткилишь на свету и только в сосудах с кислородом. В этом варианте в присутствии БР в среде инкубации водорослей клеткисущественно отличались от клеток контрольных вариантов. Так уже после 15 мин освещения суспензии наблюдали частичную потерю подвижности, а при дальнейшем освещении в течение 30 мин - округление с последующим лизисом клеток(фиг. 2). Полученные данные указывают на то, что БР обладает сильным токсичным действием фотодинамической природы и может быть использован в качестве эффективного сенсибилизатора фотодинамических процессов. В таблице представлены результаты подсчета клеток водорослипосле внесения в культивационную среду сенсибилизаторов и инкубации 30 мин на свету. Контролем служили клетки, инкубированные на стандартной среде Крамера-Майерса, без сенсибилизаторов. Светкислород Свет без кислорода подвижные неподвижные подвижные неподвижные тысяч клеток (в скобках процент от общего числа) Контроль 893 (100) единичные 879 (100) единичные 863 (97),Эозин единичные 735 (82) 161 (18) из них 486 (54) округленные Флуоресцеин 845 (95) 50 (5) 887 (100) единичные Бенгальский розо 873 (98),15 (2) 899 (100) единичные вый из них 585 (66) округленные 3 15504 1 2012.02.28 Важным является тот факт, что механизм фототоксичного действия различных фотосенсибилизаторов одинаков, что позволяет предполагать аналогичный ответ клетокна внесение в среду инкубации других фотосенсибилизаторов. Способ оценки фототоксичности фотосенсибилизатора, основанный на визуальном наблюдении с помощью светового микроскопа за подвижностью и формой одноклеточной водоросли, является более простым, быстрым и дешевым по сравнению с известными способами. Он обеспечивает упрощение оценки фототоксичности фотосенсибилизаторов и снижение затрат на исследования. Данный способ позволит существенно модернизировать процесс скрининга фотосенсибилизаторов при разработке высокоэффективных фотодинамических гербицидов, а также получении препаратов для терапии онкологических заболеваний. Способ является актуальным для применения в научных лабораториях, на химическом и фармакологическом производстве. Источники информации 1. Аверина Н.Г., Шалыго Н.В., Яронская Е.Б., Рассадина В.В. Фотодинамический эффект и особенности накопления порфиринов в растениях, обработанных 5-аминолевулиновой кислотой и 2,2-дипиридилом // Физиология растений. - 1988. - . 35. Выпуск 4. - С. 679-686. 2., - .,,. .//. . - 1984. - . 6. - . 390-401. 3.,,,-// . . 1989. - . 22. - . 197-200. 4. Воробей А.В. Сенсибилизируемые порфиринами фото динамические повреждения биологических мембран // Фотобиология и мембранная биофизика / Под ред. И.Д.Волотовского. - Минск Технопринт, 1999. - С. 300-317. 5.,.,.. -// .. - 1989. - . 135. - . 164-169. 6..,.// Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4