Способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семейства Enterobacteriaceae

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ИЛИ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА НА РОСТ ТЕСТ-ШТАММА БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Филонов Валерий Петрович Колядич Елена Сергеевна Мельникова Людмила Александровна Лилишенцева Анна Николаевна Иващенко Наталья Ивановна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(57) Способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семейства , заключающийся в том, что культивируют тест-штамм при температуре 30-37 С в жидкой питательной среде, содержащей растительный экстракт, а также в жидкой питательной среде, содержащей экстрагент, каждый час измеряя оптическую плотность бактериальных суспензий при длине волны 540 нм до достижения ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной фазы роста тест-штамма, после чего рассчитывают отношение оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с растительным экстрактом к оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с экстрагентом и при отношении, равном единице, определяют, что растительный экстракт не оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тест-штамма, при отношении больше единицы - оказывает стимулирующее, а при отношении меньше единицы - оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной среды используют среду с 7,2-7,4, содержащую, г/л аммоний хлористый 1,00,1 калий фосфорнокислый однозамещенный 3,00,1 натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,00,1 натрий хлористый 0,50,1 глюкоза 2,50,5 вода остальное. 15228 1 2011.12.30 Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и фармакологии. Известен способ оценки антимикробной активности растительных экстрактовс использованием тест-культур бактерий 1, заключающийся в том, что в центр на поверхности засеянного тест-штаммами микроорганизмов питательного агара располагают диски из стерильной фильтровальной бумаги, предварительно импрегнированные растительным экстрактом, растирают поверхность питательного агара стеклянным шпателем, а затем чашки с посевами микроорганизмов инкубируют в термостате. После инкубации с помощью кронциркуля измеряют диаметр зоны просветления и выражают в миллиметрах диаметр зоны ингибирования роста микроорганизмов. Однако способ-прототип обладает низкой воспроизводимостью и чувствительностью,в связи с чем требуется длительное, до 24 часов, время проведения испытаний, и не дает возможности оценить стимулирующее действие растительных экстрактов на микроорганизмы. Кроме того, эффект воздействия экстракта на тест-культуру в значительной степени определяется способностью экстракта диффундировать в агар, что может исказить результаты. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение растительных экстрактов в питательную среду, содержащую ранее определенную концентрацию бактериальной тест-культуры, и проводят их совместное культивирование в термостате с последующей обработкой полученных данных. Задача заявленного изобретения - повышение воспроизводимости и чувствительности способа. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ определения стимулирующего или ингибирующего действия растительного экстракта на рост тест-штамма бактерий семействапутем культивирования тест-штамма при температуре 30-37 С в жидкой питательной среде, содержащей растительный экстракт, а также в жидкой питательной среде, содержащей экстрагент, каждый час измеряя оптическую плотность бактериальных суспензий при длине волны 540 нм до достижения ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной фазы роста тест-штамма, после чего рассчитывают отношение оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с растительным экстрактом к оптической плотности бактериальной суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с экстрагентом и при отношении, равном единице, определяют, что растительный экстракт не оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тест-штамма, при отношении больше единицы - оказывает стимулирующее, а при отношении меньше единицы - оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной среды используют среду с рН 7,2-7,4, содержащую, г/л аммоний хлористый 1,00,1 калий фосфорнокислый однозамещенный 3,00,1 натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,00,1 натрий хлористый 0,50,1 глюкоза 2,50,5 вода остальное. Мы исходили из того, что рост микроорганизмов на питательной среде имеет, как правило, несколько фаз лаг-фазу, выраженную фазу быстрого роста культуры (логарифмическую фазу), фазу замедления роста, стационарную фазу и фазу отмирания. Стационарная фаза роста характеризуется максимальным накоплением биомассы культуры. Поэтому для оценки модулирующей активности водных экстрактов растений целесообразно выбрать стационарную фазу роста, а накопление биомассы оценивать по оптическим показателям в жидкой питательной среде. Для этой цели был оптимизирован состав среды культивирования. Питательный состав должен быть сбалансирован таким образом,2 15228 1 2011.12.30 чтобы обеспечить нормальное развитие тест-микроорганизма, но при этом не должен маскировать как ингибирующее, так и стимулирующее действие растительных экстрактов. Кроме того, среда должна быть прозрачна, бесцветна (или слегка окрашена). Согласно нашим исследованиям, такими свойствами обычно обладают синтетические или полусинтетические питательные среды. Такой прием позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость способа за счет того, что осуществляется регистрация оптической плотности клеточной суспензии в период стационарной фазы развития роста тест-штамма в питательной среде, содержащей и не содержащей испытуемый экстракт. При этом в качестве тест-культуры используют бактерии семейства(роды ,и другие роды). Штаммы могут быть получены из государственных музеев и коллекций, а также быть выделены в виде изолятов в ходе микробиологических исследований. Пример выполнения. Требуется определить модулирующее действие трех растительных экстрактов пряноароматических и лекарственных растений 1 образец - экстракт шалфея лекарственного 2 образец - экстракт лимонника китайского 3 образец - экстракт плодов шиповника. В качестве бактериальных тест-штаммов используют палочковидные грамотрицательные бактерии 25922,14028, полученные из Американской коллекции типовых культур микроорганизмов и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Используемые штаммы являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Для приготовления рабочих культур производят отсев бактериальных тест-штаммов на косяки мясопептонного агара, содержащего 0,1 глюкозы и 0,2 дрожжевого экстракта, и инкубируют в термостате при (371) С в течение 18-24 ч. Смывы с косяков производят стерильным 0,85 -ным физиологическим раствором. Концентрацию клеток доводят до 109 КОЕ/см 3, используют оптический стандарт мутности на 10 ед. Подготовка водных экстрактов. Водные экстракты готовят следующим образом измельченные сухие растения и целые плоды заливают горячей водой, соблюдая гидромодуль 140, плоды лимонника и шиповника кипятят в течение 5 мин до разваривания. Экстракты оставляют для настаивания на горячей водяной бане в течение 3 ч. По окончании процесса экстракции сырье отжимают и отделяют жидкую фазу. С целью удаления микроорганизмов экстракты стерилизуют обеспложивающим фильтрованием, используя мембранные фильтрыс диаметром пор 0,22 нм. Проведение исследований. В пробирки объемом 50 см 3 с 10 см 3 питательной среды вносят 3 об.суспензии микроорганизмов с начальной концентрацией 109 КОЕ/см 3. Для оценки действия экстрактов в пробирки с питательной средой добавляют 10 об.водных экстрактов. Контролем служит питательная среда с внесенной суспензией микроорганизмов и с добавлением равного объема растворителя вместо экстрактов растений. Культивируют при оптимальной для микроорганизмов температуре 30-37 С в течение 16-20 ч до достижения стационарной фазы роста. Во время проведения эксперимента проводят измерения оптической плотности культуры. Пробы отбирают через каждый час, соблюдая правила асептики. Измерения проводят не менее чем в трех повторностях для каждого экстракта на фотометре КФК-3 (светофильтр 6, зеленый, максимум пропускания 540 нм), длина оптического пути составляла 1 см. Получены следующие результаты (таблица). 15228 1 2011.12.30 Результаты оценки модулирующего действия растительных экстрактов на бактериальные тест-штаммы Экстракт 1 2 Действие 25922 Экстракт шалфея лекарингибирующее 0,6 0,2 0,33 ственного Экстракт лимонника кистимулирующее 0,6 0,9 1,5 тайского Экстракт плодов шиповне обладает ингибирующим ника 0,6 0,6 1 или стимулирующим действием 14028 Экстракт шалфея лекарне обладает ингибирующим ственного 0,4 0,4 1,0 или стимулирующим действием Экстракт лимонника кине обладает ингибирующим тайского 0,4 0,4 1,0 или стимулирующим действием Экстракт плодов шиповстимулирующее 0,4 0,8 2,0 ника Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в количественной оценке действия растительных экстрактов на тест-штаммы бактерий в более простой пробоподготовке, т.к. отсутствует стадия импрегнирования растительным экстрактом стерильного бумажного диска, а также в исключении влияния скорости диффузии экстракта в агар на результаты определения. Источники информации 1.., ,Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4