Способ диагностики острого язвенно-некротического гингивита

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ЯЗВЕННО-НЕКРОТИЧЕСКОГО ГИНГИВИТА(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Юдина Наталья Александровна Костюк Светлана Андреевна Люговская Анна Викторовна Глинкина Татьяна Владимировна Полуян Ольга Сергеевна Руденкова Татьяна Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ диагностики острого язвенно-некротического гингивита по выявлению, отличающийся тем, что выделяют из зубного налета сорбционным методом ДНК микроорганизмов и проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров для детекции 5-3 и 53 иолигонуклеотидного меченого зонда 5-3 на этапе амплификации ДНК, причем проводят денатурацию ДНК при температуре 94 С в течение 2 минут, отжиг в количестве 30 циклов сначала при температуре 94 С в течение 45 секунд, а затем при температуре 62 С в течение 60 секунд и элонгацию в количестве 30 циклов при температуре 72 С в течение 60 секунд, а концентрацию ДНКрассчитывают по формуле 10(-0,33312,843)/0,7,где- значение цикла амплификации ДНК при флуоресценции, превышающей пороговый уровень,и при получении значенияболее 105 копий на 1 мл зубного налета диагностируют острый язвенно-некротический гингивит. Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может использоваться для диагностики острого язвенно-некротического гингивита с целью установления этиологического фактора заболевания. 14153 1 2011.04.30 Ведущая роль в развитии острого язвенно-некротического гингивита принадлежит микробному фактору. Среди бактериальной флоры особое значение в этиопатогенезе заболевания играет. Методы клинической диагностики не позволяют выявить этиологически значимый возбудитель, что не дает объективную оценку патологическому процессу в тканях периодонта, снижает точность диагностики и эффективность терапии. В связи с этим, наряду с использованием клинических методов исследования,необходимо проведение специальных методов, позволяющих выявить этиологически значимый возбудитель и определить его количественную характеристику. Задачей изобретения является выявлениев зубном налете, что поможет повысить точность диагностики, провести адекватные лечебные мероприятия и оценить эффективность проведенного лечения. Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ диагностики острого язвенно-некротического гингивита по выявлению, при котором выделяют из зубного налета сорбционным методом ДНК микроорганизмов и проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров для детекции 53 и 53 иолигонуклеотидного меченого зонда 53 на этапе амплификации ДНК, причем проводят денатурацию ДНК при температуре 94 С в течение 2 минут, отжиг в количестве 30 циклов сначала при температуре 94 С в течение 45 секунд, а затем при температуре 62 С в течение 60 секунд и элонгацию в количестве 30 циклов при температуре 72 С в течение 60 секунд, а концентрацию ДНКрассчитывают по формуле 10(-0,33312,843)/0,7,где- значение цикла амплификации ДНК при флуоресценции, превышающей пороговый уровень,и при получении значенияболее 105 копий на 1 мл зубного налета диагностируют острый язвенно-некротический гингивит. На фиг. 1 представлена стандартная кривая, определяющая взаимосвязь концентрации ДНКи цикла , при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплифицированного продукта пересекаются. Пример. Пациент Н., 21 год. Жалобы на болезненность десны и неприятный запах изо рта, повышение температуры тела до 37,1 С. При осмотре десна гиперемирована, кровоточит, вершины межзубных сосочков некротизированы, покрыты серым, плохо снимающимся налетом. При пальпации десна резко болезненна. Индекс гигиены 2,6 (гигиена плохая). Для выявления у пациента Н. ДНКв качестве биологического материала используют зубной налет, так как здесь данный микроорганизм проявляет свою наибольшую активность. Забор биологического материала осуществляют из десневой борозды в различных секстантах. Стерильный бумажный штифт размером 35 вводят в десневую борозду и оставляют на 10 секунд, забранный материал погружают в герметично закрытый стерильный контейнер для транспортировки с транспортной средой. С выделенной сорбционным методом из зубного налета ДНКпроводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, при этом осуществляют амплификацию ДНКобщим объемом 100 мкл и ДНКстандартов, которые необходимы для определения концентрации ДНК при проведении ПЦР в режиме реального времени. Используемыми стандартами для определения концентрациислужат 10-кратно разведенные серии геномаизвестных концентраций в диапазоне от 104 до 107 копий/мл. Проводят подготовку пробирок с ПЦР-смесью-1, содержащей смесь специфических праймеров, позволяющих детектировать специфический фрагмент ДНК, и нуклеотиды, раскапанные под воск. 2 14153 1 2011.04.30 Размораживают пробирку с ПЦР-смесью-3, содержащуюолигонуклеотидный меченый зонд, который комплементарен специфическому фрагменту ДНК, и тщательно перемешивают содержимое. Праймеры для детекциии последовательностьолигонуклеотидного меченого зонда были выбраны из гена 16 РНК (номер в 85438) с использованиемпрограммного обеспечения 53 - (-праймер),53-(-праймер) определяют границы фрагмента гена 16 РНК длиной 860 пар нуклеотидов(номер в 85438)олигонуклеотидный меченый зонд 5(АМ) 3 метитсяв качестве флуорофора по 5 концу ипо 3 концу в качестве гасителя. Готовят ПЦР-смесь из расчета 7 мкл ПЦР-смеси-2 (буфер и полимераза) и 3 мкл ПЦРсмеси-3 на одну реакцию. В пробирки с ПЦР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл приготовленной ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1. В подготовленные таким образом пробирки вносят ДНК по следующей схеме пробирка 1-5 мкл ДНК, выделенной из биологического материала,пробирка 2-5 мкл Стандарт 1(конц. 104 копий/мл),пробирка 3-5 мкл Стандарт 1(конц. 104 копий/мл),пробирка 4-5 мкл Стандарт 2(конц. 105 копий/мл),пробирка 5-5 мкл Стандарт 2(конц. 105 копий/мл),пробирка 6-5 мкл Стандарт 3(конц. 106 копий/мл),пробирка 7-5 мкл Стандарт 3(конц. 106 копий/мл),пробирка 8-5 мкл Стандарт 4(конц. 107 копий/мл),пробирка 9-5 мкл Стандарт 4(конц. 107 копий/мл),пробирка 10-5 мкл отрицательного контрольного образца. Помещают пробирки в ячейки ротора термоциклера 3000 ( , Австралия). Задают следующую программу для амплификации ДНК 1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) 94 С 2 мин 2. Отжиг (присоединение праймеров) 94 С 45 сек 62 С 60 сек 3. Элонгация (достраивание цепей ДНК) 72 С 60 сек Отжиг и элонгацию проводят в количестве 30 циклов. Этап амплификации при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиеммеченого олигонуклеотидного зонда основан на использовании 5-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют зонд, меченный на 5-конце флуоресцентным красителем, а на 3 конце - фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Зонд комплементарен участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров меченый зонд количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять зонд за счет 5-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может детектироваться. Увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходной концентрацией матрицы, что дает возможность точно оценить концентрацию ДНК в биологическом материале. 3 14153 1 2011.04.30 Для определения концентрацииДНКв зубном налете строится стандартная кривая в следующих координатах- концентрация стандартов,- пороговый цикл(пороговый цикл - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплифицированного продукта пересекаются). Значенияпредсказываются, исходя из оценки входного уровнямеченого олигонуклеотидного зонда, то есть в стандартных условиях реакции, чем больше начальная концентрация образца, тем меньше(фиг. 1). Образец считается положительным, если в таблице результатов пороговых циклов по каналудля него определяется значение порогового цикла, не превышающее 33. Отсутствие исследуемой ДНК ведет к отсутствию пересечения кривой флуоресценции порогового значения. Итоговые уравнения, характеризующие взаимосвязь порогового цикла флуоресценциии количества амплифицированной ДНК 10(-0,33312,843)/0,7 используется для расчета концентрации ДНКв 1 мл зубного налета, где 0,7 - коэффициент , соответствующий эффективности выделения ДНКсорбционным методом. При определении концентрации ДНКпутем количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованиемолигонуклеотидного меченого зонда и смеси праймеров для проведения амплификации ДНКу данного пациента значение порогового цикла 19,00, поэтому 10(-0,33319,0012,843)/0,74687076 копий на 1 мл биологического материала зубного налета. Диагностически значимой считается концентрацияДНКболее 5 10 копий на 1 мл зубного налета. Если полученная концентрация ДНКсоответствует диагностически значимой, то ставят диагноз острый язвеннонекротический гингивит. У пациента Н. обнаружена диагностически значимая концентрацияв зубном налете, что позволяет поставить данному пациенту диагноз острый язвеннонекротический гингивит. Проведено комплексное этиопатогенетическое лечение, которое включало назначение антибактериального препарата, антисептическую обработку, проведение профессиональной гигиены. При повторном обследовании выявлена ДНКв концентрации 103 копий на 1 мл зубного налета, что отражает эффективность проведенного лечения. Таким образом, заявленный способ позволяет диагностировать острый язвеннонекротический гингивит, выбрать тактику лечения, а также оценить эффективность проведенной терапии за счет установления преимущественной роли патогенав развитии острого язвенно-некротического гингивита. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4