Средство для стимуляции выработки фактора VIII свертывания крови

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВЫРАБОТКИ ФАКТОРАСВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ(71) Заявитель Бизяев Алексей Вячеславович(73) Патентообладатель Бизяев Алексей Вячеславович(57) Средство для стимуляции выработки факторасвертывания крови у больного гемофилией , содержащее ксеногенные поликлональные иммуноглобулины классас молекулярной массой 150 кДа к антигенам эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга донора. Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, содержащим антитела, а именно иммуноглобулины. Оно может быть использовано при лечении гемофилии А, обусловленной недостаточной выработкой или отсутствием выработки факторав организме больного. Гемофилия А - это наследственное заболевание, обусловленное дефицитом или, реже,наследственной молекулярной аномалией факторасвертывания крови. По данным 2003. .-1.- . 94-103, она встречается примерно в одном случае на 5000 лиц мужского пола и характеризуется спонтанными кровоизлияниями в мягкие ткани и суставы, которые вызывают тяжелые геморрагические осложнения, такие как гемартрозы, гемомиазиты и т.п. Гемофилия сопровождается также снижением иммунитета к вирусным и бактериальным инфекциям. Тяжесть осложнений строго коррелирует со степенью дефицита факторав плазме больного. У здорового человека концентрация факторав плазме крови составляет 150 нг/мл. Различают три степени тяжести гемофилии А в зависимости от концентрации факторалегкая - при концентрации 13560 1 2010.08.30 фактора 5-25 от нормы, средней тяжести - при концентрации фактора 1-4 от нормы и тяжелая - при концентрации фактораменее 1 от нормы. Известно Нильссон И.Н. Гемофилия.- Санкт-Петербург, 1999.- 101 с., что снижение или отсутствие выработки факторау больных гемофилией А связано с рядом причин,из которых одна из основных - усиление функции генов - супрессоров синтеза факторанаряду с этим снижение выработки фактораможет быть результатом ослабленного образования организмом клеток-продуцентов фактора . Адекватная терапия гемофилии А должна быть направлена на подавление активности супрессоров выработки фактора , стимуляцию функции клеток-предшественников эндотелиоцитов и усиление функции выработки фактора . Однако до настоящего времени не существовало препаратов, влияющих на перечисленные процессы. Современное лечение больных гемофилией А заключается во введении им свежезамороженной плазмы донорской крови, криопреципитата, а также концентратов факторасвертывания крови Якунина Л.Н. и др. Современные принципы лечения детей, больных гемофилией // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.- 2004.Т. 3.-2.- С. 1-4. Указанное лечение не приводит к выздоровлению и может вызвать ряд осложнений, связанных с инфузионной терапией, в первую очередь гепатиты. Однако самым большим недостатком заместительной терапии является то, что она подавляет собственную выработку фактора , в результате чего больной нуждается в постоянных регулярных инъекциях указанных препаратов. В основу изобретения поставлена задача получения лекарственного препарата, стимулирующего выработку факторасвертывания крови у больного гемофилией А. Согласно изобретению предложено средство для стимуляции выработки факторасвертывания крови, содержащее поликлональные иммуноглобулины классас молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток. Заявляемое средство может быть получено как ксеногенный гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток. Иммуноглобулины класса , подклассов 1-4 имеют одинаковые константные регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные участки различия в вариабельных участках приводят к различию основных эффекторных характеристик. Выработанные как результат гуморального ответа на эндотелиальные и мезинхимальные стволовые клетки, они стимулируют функциональную активность эндотелиальных клеток, регулируют развитие клеток-предшественников эндотелиоцитов и активируют мезинхимальные стволовые клетки. Заявляемое средство может быть получено следующим образом. Для получения антигена трепанобиоптат донорского костного мозга, включающий эндотелиальные, эндостальные и периостальные мезенхимальные стволовые клетки, отмывали от форменных элементов крови физиологическим раствором, измельчали механическим перетиранием до однородного состояния и взвешивали в физиологическом растворе. Однородную взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость трижды замораживали и оттаивали, после чего снова перетиралии центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Содержание белка в надосадочной жидкости определяли биуретовым методом и доводили разбавлением физиологическим раствором до концентрации 2,2 мг/мл. Полученный таким образом антиген вводили животному в количестве 2,2 мг на 1 кг массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут быть использованы любые биологические ксеногенные объекты, способные дать гуморальный иммунный ответ на введение чужеродного белка, например домашний и крупный рогатый скот. Первая инъекция антигена проводилась в полном адъюванте Фрейнда или иного стимулятора иммунного ответа. Последующие инъекции проводились с интервалом 2 13560 1 2010.08.30 2-7 дней так, чтобы весь курс иммунизации занимал 20-50 дней. У иммунизированного объекта забирают кровь в стерильную посуду без консервантов и антикоагулянтов. Норма забора крови у животного не превышает 10 мл/кг массы тела. После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную жидкость (сыворотку) перенесли в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделили из надосадочной жидкости высаливанием, осадок отделили, растворили в дистиллированной воде и разделили на фракции хроматографически. Фракцию, соответствующую классу , вымыли специальным элюатом и очистили диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор стерилизовали фильтрацией, дозированно разлили и высушили в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 25 . Ампулы запаивали. Каждая ампула содержала разовую дозу заявляемого средства. Хранение препарата осуществляли при 4 С в темном месте сроком не более 24 месяцев. В качестве источника антигенного материала - эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток человека могут быть использованы ткани периостальных, эндостальных и интерстициальных пространств костного мозга, полученные в виде трепанобиоптатов костного мозга от здоровых доноров. Полученный антиген, содержащий эндотелиальные и мезинхимальные стволовые клетки, можно использовать сразу после получения или хранить в замороженном состоянии до употребления. Вариант осуществления изобретения. Изобретение иллюстрируется примерами получения и применения заявляемого средства. Пример. Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных точках тела ей ввели по 55 мг антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество антигена с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза антигена составила 1,54 г. Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к эндотелиальным и мезенхимальным стволовым клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с 4-й. Перед пятой инъекцией титр антител составил 1512, перед шестой - 11024, перед эксфузией крови 12048. Через 7 дней после последнего введения антигена из яремной вены козы взяли без консерванта 250 мл крови. Сыворотку отделили от сгустка и форменных элементов крови центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием, осадок растворили в дистиллированной воде, концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в хроматографическую колонку и после разделения на фракции иммуноглобулиныэлюировали 0,025 М трис-7,8-0,15 М трис- буфером с 7,8. Раствор подвергли диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией через миллипоровские фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Жидкий стерильный раствор разлили по 1 мл в ампулы. Содержание белка в одной дозе составило 5 мг. Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60 до 37 С). Ампулы герметически запаивали. До использования средство хранили при 4 С. Титр антител в готовом препарате составил 11200 к антигенам эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток. Остаточная влажность 3 мас. . Лиофилизированный препарат представляет собой белую пористую гигроскопическую массу, растворяющуюся без остатка в воде или физологическом растворе при комнатной температуре в течение 60 с. Содержимое ампулы растворяется в 1 мл воды, раствор прозрачный, слегка опалесцирующий. Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его способности вызывать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих те 3 13560 1 2010.08.30 стах, а также лимфотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача.- С.-Петербург, 1998.- 156 с. при действии на форменные элементы крови концентратами заявляемого средства. В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, ее окраски стандартными красителями, целостность органелл клеток не нарушена. Заявляемое средство было испытано на больных гемофилией А в тяжелой форме. Для испытаний были выбраны больной Г. 14 лет, больной Ц. 22 лет и больной И. 38 лет. Все обычно получали инъекции факторапо 500-600 международных единиц и криопреципитата в количестве 8-10 доз внутривенно с частотой один раз в 2-3 дня. Лечение заявляемым средством проводили в течение 3 дней курсом из 3 внутривенных инъекций в дозе 0,05-0,1 мг средства на килограмм веса больного. Наблюдение проводили в течение 35 суток. Результаты исследования представлены в таблице. Уровень факторав плазме крови больных гемофилией ( от нормы) Исходный Количество переливауровень Через Через Через 35 Пациент Возраст ний фактораза фактора сутки неделю суток время наблюдения Г-н М. 14 лет 0,46 0,40 1,00 1,20 1 Ц-в А. 22 года 0,42 0,60 0,63 0,79 3 И-в С. 38 лет 1,10 0,80 1,30 1,10 2 Как видно из таблицы, у больных Г. и Ц. содержание фактораповысилось (всего от трех инъекций). У больного И. содержание фактораосталось без изменений, однако улучшение общего состояния потребовало только двух переливаний фактораза 35 суток. За период наблюдения у всех больных отмечено снижение числа переливаний экзогенного факторадо единичных в месяц. Не отмечено случаев инфекционных, простудных и герпетических заболеваний, несмотря на то, что лечение проводилось зимой. Отмечено субъективное улучшение качества жизни не происходило спонтанных кровоизлияний в полости суставов, появилась большая свобода движений в суставах рук и ног,улучшились сон, аппетит и настроение больных. Заявляемое средство может применяться при лечении гемофилии А. Оно может выпускаться биотехнологической отраслью фармацевтической промышленности. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4